桔皮素對卵巢癌SKOV3 細胞的體外作用及作用機制*

劉瑩瑩，陽劉康，盧 偉，張遠洋，劉 偉△

（1.湖北省十堰市太和醫院·湖北醫藥學院附屬醫院，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫藥學院基礎醫學院，湖北 十堰 442000）

卵巢癌疾病早期缺乏有效的生物診斷標志，導致超過70%的患者確診時已為晚期，5 年生存率低于30%［1-2］。桔皮素是一種提取于川橘果皮和柑橘莖葉等的黃酮類化合物，具有抗菌、抑制惡性腫瘤細胞和嗜堿性細胞組胺釋放等作用［3］，可有效抑制結腸癌和乳腺癌細胞體外的增殖［4］。Ras/ 絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（MEK）/ 細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路在癌癥中常被解除調控，對于癌癥的發生起關鍵作用［5］。約15%的癌癥中存在突變的Ras 致癌形式，約30%的癌癥中ERK 過度激活對于Ras/ MEK/ ERK 信號通路的解除起調節作用［6］。此外，在黑色素瘤、甲狀腺癌、結直腸癌中均發現Ras/MEK/ERK 信號通路的異常表達［7］。盡管MEK 本身的激活突變在人類癌癥中尚未被發現，其在ERK 通路中的中心作用被認為是治療人類癌癥的重要靶點［8］。本研究中探討了桔皮素對卵巢癌細胞的體外作用及其對Ras/MEK/ERK 信號通路的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：BSC - 1100ⅡB2 - X 型生物安全柜、BKQ -B75 型高壓蒸汽滅菌鍋、BJPX - 300L CO2細胞培養箱（中國博科公司）；5320R 型離心機（德國徠卡公司）；伯樂Mini - PRO TEAN 型電泳儀（美國伯樂公司）；EVOS M7000 型倒置顯微鏡（意大利賽默飛公司）；LAS 4000型成像系統、Bio - Rad 型微孔板閱讀器（美國GE Healthcare 公司）；BD FACSCantoⅡ型流式細胞儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；VCX 500 型超聲細胞破碎儀（中國苑勝公司）。

試藥：桔皮素（中國食品藥品檢定研究院，批號為849542）；阿霉素（南京建成生物有限公司，批號為621548）；RPMI 1640 培養基（批號為2154849），胎牛血清（批號為5549154），胰蛋白酶（批號為8444124），均購自美國Gibco 公司；細胞計數試劑盒8（CCK-8，上海優寧維生物有限公司，批號為2011252）；V-熒光素異硫氰酸酯（FITC）凋亡試劑盒（美國Sun-Shine公司，批號為2011594）；Ras 蛋白抗體（批號為20205949），MEK 蛋白抗體（批號為20206423），ERK 蛋白抗體（批號為20205571），β-actin 蛋白抗體（批號為20178849），均購自美國Abcam 公司；山羊抗兔二抗（武漢三鷹生物有限公司，批號為59487145）。

細胞：卵巢癌SKOV3細胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 方法

細胞培養：從液氮罐中取卵巢癌SKOV3 細胞株凍存管1 支進行細胞復蘇，將復蘇后的細胞置RPMI 1640培養基中，采用細胞培養皿進行分裝，并放置在37 ℃、5%CO2培養箱中培養，24 h 后更換培養基，當細胞覆蓋率達到70%時，在培養皿中加入胰蛋白酶進行細胞傳代。在指定時間內，用不同質量濃度（2，5，10μmoL/L）的桔皮素和75 nmol/L阿霉素處理細胞［9］。

細胞分組：將細胞分為空白對照組（A組，0μmol/L），陽性對照組（B組，阿霉素75 nmol/L），桔皮素低、中、高劑量組（分別為C1組、C2組、C3組，桔皮素2，5，10μmol/L）。

細胞處理：取對數生長期的卵巢癌SKOV3細胞，在培養皿中加入1 mL 胰蛋白酶，輕微吹打2 min，使細胞完全懸浮。將懸浮的細胞轉移至1.5 mL 離心管中，離心（轉速為2 000 r/min）10 min，棄去上清液；加入1 mL RPMI 1640 培養基，并輕微吹打細胞，使細胞充分懸浮，將細胞懸液轉移至96孔板中，每孔100μL，在培養箱中培養24 h，棄去96 孔板中的培養基；每孔中依次加入新的RPMI 1640 培養基。按細胞分組項下方法加入藥物，每組6個復孔，培養24 h，棄去培養液。

CCK-8 法檢測細胞存活率：取細胞處理項下的各組細胞，每孔加入100 μL 培養液和10 μL CCK - 8 溶液，持續培養3 h，使用Bio - Rad 型微孔板閱讀器讀取450 nm波長處的吸光度，重復3次，并計算細胞存活率。

改良Matrigel Boyden 室測定法測定細胞侵襲性：取細胞處理項下的各組細胞，將細胞接種至有基質膠的濾膜上，濾膜下室倉中放入10%胎牛血清，作為趨化劑，放入培養箱中培養24 h，取出濾膜，染色，使用EVOS M7000 型倒置顯微鏡對濾膜上的細胞進行計數。每個濾膜隨機選擇5個視野，重復3次，取平均值。

流式細胞儀檢測細胞凋亡率：取細胞處理項下的各組細胞，使用FITC凋亡試劑盒，用磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2 次，用1X 結合緩沖液在1×106個細胞/mL 濃度下懸浮于400μL V-FITC溶液中，黑暗中室溫孵育15 min，加入PI 10 μL，4 ℃避光孵育5 min，立即用BD FACSCanto Ⅱ型流式細胞儀分析細胞，重復3次。

蛋白免疫印跡法檢測細胞Ras，MEK，ERK 蛋白表達水平：取細胞處理項下的各組細胞，取出培養皿，放入無菌操作臺，棄去培養皿中的培養液，并加入1 mL 磷酸鹽緩沖液和100μL 蛋白酶K 溶液，使細胞懸浮，采用VCX 500 型超聲細胞破碎儀作用2 min 破碎細胞，采用5320R 型離心機離心（轉速為3 000 r/min），4 ℃下處理20 min，取上清液，置1 支新的1.5 mL EP 管中。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離、轉膜、封閉，用特異性抗體Ras，MEK，ERK，β-actin于4 ℃下孵育12 h，用1%吐溫清洗孵育后的條帶3 次，二抗孵育2 h，經LAS 4000 型成像系統成像，并觀察結果。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行單因素方差分析，并采用LSD-t檢驗行多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞存活率、侵襲細胞數和凋亡率

與A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組卵巢癌SKOV3的細胞存活率均顯著降低，細胞凋亡率均顯著升高，侵襲細胞數均顯著減少，且C1組、C2組、C3組效應呈劑量依賴性（P＜0.05）；但C3組和B 組上述指標比較均無顯著差異（P＞0.05）。詳見表1、圖1和圖2。

圖2 桔皮素對卵巢癌SKOV3細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of tangeretin on apoptosis rate of ovarian cancer SKOV3 cells

表1 桔皮素對卵巢癌SKOV3細胞存活率、凋亡率、侵襲細胞數的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of tangeretin on survival rate，apoptosis rate and invasion number of ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

表1 桔皮素對卵巢癌SKOV3細胞存活率、凋亡率、侵襲細胞數的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of tangeretin on survival rate，apoptosis rate and invasion number of ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

注：與A組比較，aP ＜0.05；與C1組比較，bP ＜0.05；與C2組比較，cP ＜0.05；與B組比較，dP ＜0.05。表2同。Note：Compared with those in group A，aP ＜0.05（for Tab.1-2）；Compared with those in group C1，bP ＜ 0.05（for Tab.1 - 2）；Compared with those in group C2（for Tab.1 - 2），cP ＜ 0.05；Compared with those in group B，dP ＜0.05（for Tab.1-2）.

組別A組B組C1組C2組C3組藥物濃度0 75 nmol/L 2μmol/L 5μmol/L 10μmol/L細胞存活率（%）98.11±8.55 31.17±6.29abc 78.22±8.62ad 55.35±8.53abd 31.26±6.74abc細胞凋亡率（%）14.83±4.37 61.84±5.89abc 24.59±4.28ad 41.28±4.77abd 61.71±5.36abc侵襲細胞數（個）169.57±13.55 71.53±11.53abc 131.55±12.78ad 102.87±12.89abd 72.45±11.77abc

2.2 Ras，MEK，ERK 蛋白表達水平

與A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組卵巢癌SKOV3細胞Ras，MEK，ERK 蛋白表達水平均顯著降低，且C1組、C2組、C3組效應呈劑量依賴性（P＜0.05）；C3組和B組上述指標比較均無顯著差異（P＞0.05）。詳見表2和圖3。

圖3 桔皮素對卵巢癌SKOV3細胞Ras，MEK，ERK蛋白表達的影響Fig.3 Effect of tangeretin on the expression of Ras，MEK and ERK protein in ovarian cancer SKOV3 cells

表2 桔皮素對卵巢癌SKOV3細胞Ras，MEK，ERK蛋白表達水平的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of tangeretin on the expression levels of Ras，MEK and ERK proteins in ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

表2 桔皮素對卵巢癌SKOV3細胞Ras，MEK，ERK蛋白表達水平的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of tangeretin on the expression levels of Ras，MEK and ERK proteins in ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組藥物濃度0 75 nmol/L 2μmol/L 5μmol/L 10μmol/L Ras/β-actin 0.92±0.08 0.17±0.04 abc 0.69±0.07ad 0.32±0.05abd 0.21±0.05abc MEK /β-actin 0.81±0.07 0.15±0.04 abc 0.57±0.06ad 0.35±0.05abd 0.17±0.04abc ERK/β-actin 0.94±0.09 0.27±0.05abc 0.82±0.09ad 0.59±0.08abd 0.38±0.05abc

3 討論

卵巢癌的發病率在女性惡性腫瘤中僅次于宮頸癌和子宮體癌，卵巢上皮癌是死亡率最高的婦科腫瘤［10］。由于卵巢體積小且位于盆腔內，卵巢癌早期無明顯臨床癥狀，易錯過最佳治療時間，導致癌細胞擴散至盆腔內的臟器時，疾病已發展至晚期，增加了臨床治療的難度［11］。桔皮素具有抑制癌細胞增殖、黏附、轉移、凋亡等潛在的抗癌作用［12］，可通過降低過氧化應激引起的前列腺癌細胞中相關氧化應激因子的表達水平來抑制細胞的侵襲和逆轉。此外，桔皮素還可減弱乳腺癌、肝癌和肺癌細胞的生存能力，并誘導其凋亡［13］。本研究中檢測了不同濃度的桔皮素對卵巢癌SKOV3 細胞的影響，由表1 可知，桔皮素可促進卵巢癌SKOV3 細胞的凋亡，抑制其增殖，減弱其侵襲能力，且呈劑量依賴性，表明桔皮素可有效減慢卵巢癌SKOV3 細胞的增殖速度，通過抑制其侵襲能力而阻止腫瘤細胞擴散，同時通過增加其細胞凋亡率而延緩疾病進程。

Ras/MEK/ERK 信號通路與機體氧化應激密切相關，其異常高表達在多種癌癥的轉移過程中起關鍵作用［14］。ERK 是機體中維持細胞氧化還原平衡的關鍵翻譯因子［15］，其表達的增加可誘導下游基因Ras 和MEK的表達，使細胞內氧化應激因子羥自由基水平升高，進一步加重機體氧化應激，導致腫瘤細胞增殖和遷移的活性增加，加重病情［16］。由表2 可知，未對卵巢癌SKOV3細胞進行任何處理時，Ras，MEK，ERK 蛋白均呈高表達；給予桔皮素干預后，Ras，MEK，ERK 的蛋白表達均下調，且具有明顯的劑量依賴性?？梢娊燮に乜赡芡ㄟ^調節Ras/MEK/ERK 信號通路來降低細胞內氧化應激，下調細胞氧化應激因子的表達，從而抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖和侵襲，并促進其凋亡。

綜上所述，桔皮素可有效抑制卵巢癌SKOV3 細胞的增殖與侵襲，并促進其凋亡，效果與桔皮素的劑量密切相關，作用機制可能與抑制Ras/MEK/ERK 信號通路的蛋白表達有關，但具體作用機制有待深入探究。