補腎活血方含藥血清對過氧化氫誘導大鼠髓核細胞焦亡的作用*

張 超，李兆勇

（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

下腰痛主要由椎間盤退變（IDD）引起，IDD 的發生和發展涉及氧化應激反應、感染、吸煙、外傷等［1］，療法主要為對癥治療，無法治愈。椎間盤內部主要由髓核組成，髓核維持了細胞外基質的完整性和椎間盤的生物力學［2］。在IDD期間，纖維環的破裂、軟骨終板的退化及炎癥會誘導活性氧產生，從而加重髓核細胞的氧化應激反應，加速細胞衰老和死亡［3］。髓核細胞的減少和功能障礙是引發IDD的主要原因［4］，故緩解髓核細胞死亡是恢復椎間盤功能及延緩IDD病程的重要策略。細胞焦亡是由激活的半胱天冬酶1（caspase-1）介導的炎性細胞死亡［5］。含NLR 家族Pyrin 域蛋白3（NLRP3）炎性小體是caspase-1 的常見激活劑，由NLRP3、PYCARD、半胱天冬酶1 酶原（pro-caspase-1）組成［6］。細胞焦亡最顯著的特征是依賴于caspase-1的激活，并伴隨炎性細胞因子白細胞介素1β（IL-1β）和白細胞介素18（IL-18）的釋放［7］。IL-1β 與IDD 密切相關，高度表達于變性的椎間盤［8］。補腎活血方由君藥杜仲，臣藥補骨脂、懷牛膝，佐使藥丹參、威靈仙、木瓜組方，具有補腎強骨、活血通絡功效，臨床治療椎間盤源性腰痛療效較好［9］。本研究中探討了補腎活血方含藥血清對過氧化氫誘導大鼠髓核細胞焦亡的作用，旨在為臨床應用提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：A51119600C型酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；1658001 型小型垂直電泳儀、1703930 型小型轉印槽（美國伯樂公司）。

試藥：細胞計數試劑盒8（CCK - 8）、乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號分別為C0037，C0016，S0131S，S0101S）；谷胱甘肽（GSH）試劑盒（美國Abcam 公司，批號為ab138881）；IL - 1β 大鼠酶聯免疫吸附試劑盒（美國Merck 公司，批號為RAB0227）；IL - 1β，caspase - 1，NLRP3，Gasdermin D（GSDMD），Beclin 1，Rab5，Rab7，LC3 Ⅱ/Ⅰ，β-肌動蛋白（β-actin）一抗，均購自美國Cell Signaling Technology 公司，批號分別為#12703，#24232s，#15101，#36425，#4122，#3547，#9367，#4108，#3700）；0.25% Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibco公司）；DMEM/F-12細胞培養基（美國HyClone 公司，批號為SH30023，含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素）；過氧化氫（美國Sigma 公司，批號為88597）；杜仲、補骨脂、懷牛膝、丹參、威靈仙、木瓜（湖南中醫藥大學第一附屬醫院，批號分別為190226，192037，183104，180527，191149，202658），經謝朝暉主任藥師鑒定為正品。

動物：SD 大鼠14 只，雄性，12 周齡，體質量250～300 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019 - 0014，飼養環境溫度為20～25 ℃，相對濕度為50%～65%，明暗交替（12 h/12 h）適應性飼養。所有動物實驗均經湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理委員會批準。

1.2 方法

補腎活血方制備［10］：取杜仲15 g，補骨脂10 g，懷牛膝10 g，丹參12 g，威靈仙10 g，木瓜9 g，加水沒過藥材表面3～5 cm，浸泡30 min，武火煮沸，文火煎煮30 min，過濾，將藥液保存于干凈的燒杯中，剩余藥渣進行第2次煎煮；加水沒過藥材表面1～2 cm，武火煮沸，文火煎煮20 min，過濾，與第1 次煎煮的藥液混合，搖勻，約400 mL，水浴蒸發至每1 mL浸膏含生藥2.97 g。

含藥血清制備：隨機選取5 只SD 大鼠，給藥前禁食12 h，每千克體質量的用藥量由標準動物劑量折算表［11］計算確定，并根據公式（大鼠每日用藥量=成人每日用藥量/正常成人體質量×換算常數×校正系數）計算補腎活血方劑量。灌胃給予生藥3.597 g/ kg，每天1次，連續7 d。大鼠眼球取血2 mL，分離得血清，備用。

大鼠原代髓核細胞分離與培養［12］：取3只SD大鼠，腹腔注射350～400 mg/kg水合氯醛，深度麻醉，分離大鼠腰椎，用鑷子分離椎間盤的髓核，切碎，用0.25% Ⅱ型膠原酶于37 ℃下消化30 min，用DMEM/F-12 細胞培養基終止消化，1 500 r/min 離心5 min，將細胞重懸，并接種至培養瓶，在37 ℃、5%CO2條件下培養，每3 d更換1次培養基。平行設置3組。

細胞活性測定：將髓核細胞接種于96孔板，密度為5 × 103個/ 孔，細胞貼壁后，棄去培養基，分別加入0，5%，10%，20%，40%，80%，100%含藥血清，添加無血清培養基至100μL，每個濃度做3個復孔，培養24 h。采用CCK - 8 測定細胞活力，篩選細胞給藥濃度。操作步驟按說明書進行。

細胞分組和處理：將髓核細胞接種于12孔板，密度為1×105個/孔，細胞貼壁后，棄去培養基。隨機分為空白對照組（A 組），模型組（B 組），含藥血清低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組）。A 組加入無血清培養基，B 組加入400μmol/L 過氧化氫，C1組、C2組、C3組的細胞分別預先用5%，10%，20%含藥血清處理2 h，用400μmol/L過氧化氫孵育4 h，備用。培養液終體積為1 mL。

LDH 活性測定：分別吸取上述各組細胞培養上清液50μL，采用LDH 試劑盒測量細胞LDH 活性，操作步驟嚴格按說明書進行。

IL - 1β 水平測定：分別吸取上述各組細胞培養上清液50μL，采用IL-1β大鼠酶聯免疫吸附試劑盒測量細胞中IL-1β的水平，操作步驟嚴格按說明書進行。

p17 和p20 表達水平測定［13］：用10%三氯乙酸沉淀蛋白，用預冷的丙酮洗滌，2×上樣緩沖液溶解，采用免疫蛋白印跡法測定p17和p20的表達水平。

NLRP3，GSDMD，Beclin 1，Rab5，Rab7，LC3 Ⅱ/ Ⅰ蛋白表達水平測定：分別吸取上述各組細胞上清液，提取蛋白質，采用十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE 分離蛋白，轉移至聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，與特異性抗體（caspase-1，NLRP3，GSDMD，Beclin 1，Rab5，Rab7，LC3 Ⅱ/ Ⅰ，β-actin，按1∶1 000 稀釋）于4 ℃下孵育，過夜，與合適的辣根過氧化物酶偶聯二抗（按1∶1 000 稀釋）室溫孵育90 min。采用增強型化學發光試劑于曝光儀下顯色，使用Image灰度掃描。

MDA 含量測定：分別吸取上述各組細胞培養上清液50 μL，采用硫代巴比妥酸法測量細胞內MDA 的含量，嚴格按MDA試劑盒說明書進行。

GSH 含量和SOD 活性測定：用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，采用蛋白質定量法測量細胞中GSH 含量和SOD活性，嚴格按GSH和SOD試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理

采用GraphPad 5.0統計學軟件分析。結果采用±s表示，單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對髓核細胞活力的影響

與空白含藥血清培養基比較，100%，80%，40%含藥血清培養基中細胞活力均顯著下降（P＜0.05），20%，10%，5%含藥血清培養基中細胞活力差異不顯著（P＞0.05），故最終選擇20%，10%，5%含藥血清。

表1 補腎活血方含藥血清對髓核細胞活力的影響（±s，%，n=3）Tab.1 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on the activity of nucleus pulposus cells（±s，%，n=3）

表1 補腎活血方含藥血清對髓核細胞活力的影響（±s，%，n=3）Tab.1 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on the activity of nucleus pulposus cells（±s，%，n=3）

注：與空白含藥血清培養基比較，*P ＜0.05。Note：Compared with those of drug-free serum，*P ＜0.05.

含藥血清0 5%10%20%細胞活力99.73±3.15 97.97±2.48 98.63±3.22 98.50±2.59含藥血清40%80%100%細胞活力88.03±2.47*71.90±2.04*63.63±4.04*

2.2 對髓核細胞焦亡的影響

與A組比較，B組細胞上清液中IL-1β、GSDMD-NT蛋白的水平、LDH 活性均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組細胞上清液中IL-1β、GSDMD-NT蛋白的表達水平、LDH 活性均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2和圖1。

表2 補腎活血方含藥血清對髓核細胞IL-1β含量和LDH活性的影響（±s，n = 3）Tab.2 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on IL-1β content and LDH activity of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

表2 補腎活血方含藥血清對髓核細胞IL-1β含量和LDH活性的影響（±s，n = 3）Tab.2 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on IL-1β content and LDH activity of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

注：與A 組比較，#P ＜0.05；與B 組比較，*P ＜0.05。表3 至表5、圖1至圖3同。Note：Compared with those in group A，#P ＜0.05（for Tab.2 - 5 and Fig.1 - 3）；Compared with those in group B，*P ＜ 0.05 （for Tab.2-5 and Fig.1-3）.

組別A組B組C1組C2組C3組IL-1β（pg/mL）57.63±11.33 975.00±73.16#794.00±49.68*570.40±34.44*446.20±52.39*LDH（%）15.44±4.25 79.92±4.18#65.44±4.26*55.10±3.99*45.42±2.11*

圖1 補腎活血方含藥血清對髓核細胞GSDMD蛋白表達的影響（n=3）Fig.1 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on the expression of GSDMD protein in nucleus pulposus cells（n=3）

2.3 對髓核細胞NLRP3 炎性小體活化的影響

與A組比較，B組細胞上清液中p17，p20，NLRP3的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組細胞上清液中p17，p20，NLRP3 的表達水平均顯著降低（P＞0.05）。詳見表3和圖2。

表3 補腎活血方含藥血清對髓核細胞NLRP3炎性小體活化的影響（±s，n=3）Tab.3 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on the activation of NLRP3 inflammasome of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

表3 補腎活血方含藥血清對髓核細胞NLRP3炎性小體活化的影響（±s，n=3）Tab.3 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on the activation of NLRP3 inflammasome of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組p17/pro-IL-1β 0.41±0.05 1.00±0.09#0.85±0.03*0.68±0.02*0.52±0.07*p20/pro-caspase1 0.39±0.08 1.00±0.07#0.47±0.06*0.28±0.03*0.26±0.02*NLRP3/β-actin 0.56±0.09 1.00±0.11#0.80±0.05*0.77±0.09*0.56±0.05*

A.電泳圖 B.數據統計圖2 補腎活血方含藥血清對髓核細胞NLRP3炎性小體活化的影響（n=3）A.Electrophoretogram B.Data statisticsFig.2 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on the activation of NLRP3 inflammasome of nucleus pulposus cells（n=3）

2.4 對髓核細胞氧化應激的影響

與A組比較，B組細胞中MDA含量顯著增加，SOD活性顯著降低，GSH含量顯著減少（P＜0.05）；與B組比較，C1組、C2組、C3組細胞中MDA含量均顯著減少（P＜0.05）；與B 組比較，C2組、C3組細胞中SOD 活性均顯著升高，GSH含量均顯著增加（P＜0.05）。詳見表4。

表4 補腎活血方含藥血清對髓核細胞氧化應激的影響（±s，n = 3）Tab.4 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on oxidative stress of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

表4 補腎活血方含藥血清對髓核細胞氧化應激的影響（±s，n = 3）Tab.4 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on oxidative stress of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組MDA（nmol/mg）1.38±0.16 4.31±0.16#3.88±0.11*3.67±0.12*3.27±0.10*SOD（U/mg）155.1 0±11.96 54.76±6.78#69.68±7.81 77.12±6.74*85.76±4.66*GSH（μmol/g）30.63±3.67 10.79±1.81#13.47±2.25 18.62±1.48*18.91±1.48*

2.5 對髓核細胞自噬信號活化的影響

與A 組比較，B 組細胞中Beclin 1 的蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，C1組、C2組、C3組細胞中Beclin 1 的蛋白表達水平顯著降低，LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與B 組比較，C2組、C3組細胞中Rab5和Rab7的表達水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見表5和圖3。

表5 補腎活血方含藥血清對髓核細胞自噬信號活化的影響（±s，n=3）Tab.5 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on autophagy signal activation of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

表5 補腎活血方含藥血清對髓核細胞自噬信號活化的影響（±s，n=3）Tab.5 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on autophagy signal activation of nucleus pulposus cells（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組Rab5 1.11±0.09 1.00±0.04 1.22±0.12 1.60±0.11*1.68±0.09*Rab7 0.89±0.07 1.00±0.08 1.47±0.11 1.48±0.14*1.53±0.05*Beclin 1 0.49±0.05 1.00±0.07#0.63±0.05*0.34±0.04*0.28±0.03*LC3 Ⅱ/Ⅰ0.66±0.04 1.00±0.07 1.57±0.17*2.46±0.14*4.04±0.09*

A.電泳圖 B.數據統計圖3 補腎活血方含藥血清對髓核細胞自噬信號活化的影響（n=3）A.Electrophoretogram B.Data statisticsFig.3 Effect of serum-containing Bushen Huoxue Recipe on oxidative stress of nucleus pulposus cells（n=3）

3 討論

椎間盤包括1 個內部富含聚集蛋白聚糖的凝膠狀髓核和1個外部富含膠原蛋白Ⅰ的纖維軟骨纖維環，其上方和下方均由透明軟骨終板交界［14］。IDD涉及與年齡相關的變化及多種壓力因素引起的組織損傷，氧化反應介導的髓核細胞死亡與IDD發生和發展密切相關［15］。

中醫學理論認為，IDD 由于腎氣不足，感受風、寒、濕邪，或由勞累外傷、損傷筋骨，致氣血運行不暢、經脈疲阻而成。根據中醫“久病入絡”理論，多數患者還兼有瘀阻，故IDD 的發生與腎虛血瘀密切相關。臨床應用補腎活血方并配合功能鍛煉，腰椎術后患者的髓核細胞輪廓明顯，可促進其功能恢復［16-17］，提示補腎活血方可通過抑制髓核細胞的減少而預防IDD 患者組織中的caspase-1，IL-1β，IL-18呈高表達，髓核細胞中活性氧的水平也升高，通常采用過氧化氫誘導髓核細胞焦亡，探討髓核細胞減少的病理和干預機制［18-19］。誘導細胞焦亡的典型途徑是caspase-1依賴性的，危險相關和病原體相關的分子模式均可激活；非典型途徑是caspase - 4/ 5 或caspase - 11 依賴性的，通常被革蘭陰性菌的脂多糖激活［20］。由于椎間盤是一個無菌環境，故本研究中主要探討補腎活血方含藥血清對過氧化氫誘導髓核細胞焦亡典型途徑激活的影響。

由表2可知，過氧化氫（400μmol/L）處理髓核細胞4 h可明顯促進細胞LDH和IL-1β釋放，上調GSDMD-NT蛋白的表達。GSDMD 是介導細胞焦亡的重要蛋白，caspase - 1 活化可裂解GSDMD，釋放GSDMD - NT，形成gasdermin 孔，細胞內外物質均可通過gasdermin 孔進行交換，使細胞體積增大，導致細胞膜破裂，發生細胞焦亡［21］。補腎活血方含藥血清可以明顯抑制過氧化氫（400 μmol/ L）誘導的髓核細胞中LDH 和IL - 1β 的釋放，下調GSDMD -NT 蛋白的表達，表明補腎活血方含藥血清可抑制髓核細胞焦亡。同時，可下調髓核細胞中p17，p20，NLRP3 蛋白的表達，表明補腎活血方含藥血清可通過抑制NLRP3炎性小體相關成分蛋白的表達而延緩髓核細胞的焦亡。

血管生成和炎癥會加重髓核細胞的氧化應激，并導致IDD 的發生和發展，故需緩解自由基引起的損害，防止惡性循環［22］。另外，氧化反應和caspase-1 激活間的關系隨情況而變化，如活性氧的產生可抑制還原型輔酶Ⅱ介導的巨噬細胞和單核細胞caspase-1的活性，以及SOD1 缺陷型小鼠巨噬細胞中caspase - 1 的活化［23-24］。由表3 可知，過氧化氫（400 μmol/ L）可促進髓核細胞中MDA 釋放，降低GSH 含量和SOD 活性。MDA 是反映組織損傷及氧化反應的重要參數，主要與機體的脂質氧化速率和強度有關。GSH 是機體內的重要調節代謝物質，與細胞內的抗氧化和解毒有關。SOD是一種重要的抗氧化金屬酶，在機體的氧化和抗氧化反應系統中具有重要調節作用。補腎活血方含藥血清可抑制過氧化氫（400μmol/L）誘導的髓核細胞的MDA釋放，并升高GSH 含量，增強SOD 活性，表明補腎活血方抑制了髓核細胞的氧化反應。

自噬是一種保守的細胞行為，可維持細胞內穩態，通過溶酶體降解錯誤折疊的蛋白質和功能失調的細胞器［25］，涉及腫瘤、糖尿病、衰老、神經退行性疾病、炎癥、肝病等多種疾病。氧化應激可加速自噬形成，而自噬可通過降解氧化物質和破壞線粒體而減少氧化損傷。自噬在過氧化氫誘導髓核細胞焦亡過程中具有重要作用，參與IDD的病理和發展［12］。由表4可知，與模型組比較，含藥血清、中、高劑量組髓核細胞中Rab5，Rab7，LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達水平顯著升高，表明補腎活血方激活了髓核細胞的自噬過程。

綜上所述，補腎活血方抑制了過氧化氫誘導的細胞焦亡、NLRP3 炎性小體的活化及氧化應激，促進了細胞自噬。該研究結果可為臨床應用補腎活血方提供一定的依據，但補腎活血方物質基礎復雜，主要活性成分和機制仍不清楚，有待進一步深入研究。