基于網絡藥理學及分子對接探討“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生的作用機制

袁名揚，周學剛，扈丹丹，蔣蕾，楊波*，彭海生*

(1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱醫科大學大慶校區藥學院，黑龍江 大慶 163319)

乳腺增生病(mammary gland hyperplasia，MGH)，也稱乳腺增生癥，是一種非炎性非腫瘤性疾病，是最常見的乳腺疾病[1]。乳腺增生好發于中年女性[2]，常表現為乳房腫塊疼痛和乳腺摸到結節，近些年發病率有越來越低齡化的趨勢。乳腺增生發病因素錯綜復雜，在中醫屬于“乳癖”范疇，與肝氣郁結、氣血瘀滯密切相關。現代醫學則認為，乳腺增生的主要病因是下丘腦-垂體-卵巢軸內分泌功能失調引起的。由于疼痛反復和治療周期漫長，乳腺增生已經嚴重的影響患者的身心健康，甚至影響到工作和生活。

西醫對于乳腺增生的治療主要采用內分泌藥物治療或手術治療方案，但效果不理想，且有副作用[3]。通過目前臨床研究，治療乳腺增生常用中醫療法，且中醫療法具有療效好、毒副作用小、患者易于接受等優點[4]。逍遙散(柴胡、當歸、白芍、茯苓、白術、甘草)是乳腺增生治療應用最廣泛的中醫方劑，很多治療乳腺增生的方劑以其作為基礎方加減而成。其中柴胡作為其君藥，同時也是治療乳腺增生用藥中出現頻次最多、比例最大的單味藥，具有行氣疏肝的作用；當歸作為臣藥，具有養血柔肝的功效。柴胡、當歸在中藥治療乳腺增生的用藥的組合使用頻次較高[5]，二者聯用，可疏肝解郁，使肝條達、疏泄，以達舒肝散郁，祛邪而不傷正之效。然而，目前對“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生的活性成分研究較少，作用機制尚不明確。

本研究基于網絡藥理學，構建“藥對-活性成分-靶點-疾病”等網絡，獲得藥物作用于乳腺增生的潛在作用靶點，并在GO數據庫和KEGG數據庫進行富集分析，預測其關鍵通路，深入探討藥對與疾病的關系，揭示“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生的潛在作用機制，為臨床治療乳腺增生提供新思路，同時也為進一步臨床試驗和基礎研究奠定理論基礎。

1 資料與方法

1.1 “柴胡-當歸”藥對活性成分及靶點蛋白的篩選 將“柴胡”和“當歸”作為關鍵詞，利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP,https://tcmsp-e.com)，分別搜索其主要化學成分；篩選口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18[6-7]的活性化合物，獲得活性成分，并提取活性成分對應的蛋白質靶點。OB是口服藥物進入系統循環轉運有效性評價的重要指標，OB數值越高代表藥物生物活性分子的DL越好[8]。通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)，將獲得的靶點進行標準化。

1.2 乳腺增生相關靶點的篩選 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)以 “Mammary gland hyperplasia” OR “MGH” 為關鍵詞檢索與乳腺增生疾病相關的靶點基因。

1.3 藥對-活性成分-作用靶點-疾病網絡的構建 利用Venn在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)獲得“柴胡-當歸”藥對活性成分與乳腺增生的交集靶點，作為潛在作用靶點。將潛在作用靶點通過Cyto-scape 3.6.0軟件構建藥對-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡的構建 將交集基因導入STRING數據庫(https://string-db.org)，將蛋白種類設定為“Homo snpiens”，根據相互作用最佳可視化分析，設置最小相互作用閾值設定為 “Highest confidence> 0.7”，去除游離蛋白質，其余設置均為默認，構建PPI網絡圖，下載csv格式文件，通過Cytoscape 3.6.0軟件進行調整。

1.5 分子對接分析活性成分與靶蛋白的結合作用 基于“1.4”項下所述PPI網絡，篩選度值排名前5位的靶標，從RCSB PDB數據庫(http://www1.rcsb.org/)下載其對應蛋白，保存為pdb文件。在TCMSP中下載“柴胡-當歸”藥對主要活性成分的結構，并保存成mol2文件。然后采用Mgltools 1.5.6軟件，去水加全氫，分離配體與受體，并保存為pdbqt文件。通過Autodock Vina 1.1.2將配體與受體進行對接，通過對接結果分析“柴胡-當歸”藥對活性成分與核心靶標之間的結合活性。若結合能 ≤-5.0 kcal·mol-1，則表明配體與受體之間可以結合；若結合能 ≤-7.0 kcal·mol-1，則表明配體與受體之間具有較好的親和力[9]。分析結果后，取核心靶標與活性成分結合活性打分最高的構象用PyMol軟件進行分析作圖。

1.6 交集基因的富集分析 借用RStudio軟件對交集基因進行GO分析和KEGG通路富集分析。篩選P<0.05[10]的生物學過程與通路，再選取靶標富集數量最多的前10條生物學過程與前30條通路，綜合相關研究文獻篩選出可能與治療乳腺增生相關的通路，作為該藥對治療乳腺增生的關鍵通路。

1.7 活性成分-關鍵靶點-關鍵通路網絡的構建 通過Cytoscape3.6.0構建活性成分-關鍵靶點-關鍵通路等多層次網絡圖，利用其中的Network Analyzer插件對自由度(Degree)等相關參數對網絡圖進行分析。

2 結果

2.1 “柴胡-當歸”藥對活性成分篩選結果 通過TCMSP數據庫檢索共獲得柴胡活性成分17種、當歸活性成分2種，合并去重后共獲得活性成分18種，豆甾醇為二者共同成分，詳見表1。

表1 “柴胡-當歸”藥對活性成分信息

2.2 乳腺增生相關靶點檢索結果 共獲得乳腺增生相關靶點4 371個。

2.3 藥對-活性成分-作用靶點-疾病網絡的分析結果 通過Draw Venn Diagram在線工具繪制韋恩圖(見圖1)共獲得“柴胡-當歸”藥對活性成分靶點與乳腺增生靶點的交集基因150個。將上述交集基因導入Cytoscape 3.6.0軟件中，構建藥對-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖(見圖2)。從該網絡圖中可以看出，該網絡含節點共163個(1個疾病節點、2個藥材節點、10個活性成分節點、150個靶點節點)，317條邊。其中疾病用黃色表示，“柴胡-當歸”藥對用綠色表示，活性成分用粉色表示，潛在作用靶點用藍色表示。

圖1 “柴胡-當歸”藥對活性成分與MGH交集基因的韋恩圖

圖2 藥對-活性成分-作用靶點-疾病網絡圖

2.4 “柴胡-當歸”藥對活性成分與乳腺增生交集基因PPI網絡 PPI網絡圖見圖3。該網絡含150個節點與1 167條邊。“柴胡-當歸”藥對可能通過白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤蛋白p53(TP53)、蛋白激酶(AKT1)及血管內皮生長因子A(VEGFA)等關鍵靶點發揮治療乳腺增生的作用。

圖3 “柴胡-當歸”藥對靶蛋白PPI網絡

2.5 活性成分與核心靶點分子對接結果 通過靶標相互作用網絡中度值排名前五的關鍵靶標AKT1、TNF、TP53、VEGFA、IL-6，將其與“柴胡-當歸”藥對的18個活性成分做分子對接驗證，統計活性成分數目，結果見表2。結果顯示，AKT1與15個活性成分結合親和性為較強或很強，TNF有17個、TP53有11個、VEGFA有13個、IL-6有11個，由此可見“柴胡-當歸”藥對的活性成分與核心靶標具有較強的結合能力。核心靶標與活性成分結合活性打分最高的構象用PyMol軟件進行分析后，見圖4。

表2 活性成分與核心靶點分子對接結果

2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析 通過RStudio軟件對交集基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，得到GO條目2 432個(P<0.05)，生物過程(BP)2 233個、細胞組成(CC)39個、分子功能(MF)160個，根據富集靶標數量由多到少進行排序，其中富集基因數排序前10位的GO分析結果見表3～5。KEGG根據P<0.05篩選得到170條通路，通路富集分析結果(前30位)見圖5。

a.AKT1與豆甾醇；b.TNF與α-菠菜甾醇；c.TP53與α-菠菜甾醇；d.VEGFA與豆甾醇；e.IL-6與豆甾醇圖4 活性成分與核心靶點分子對接結果圖

表3 GO富集分析-分子功能

表4 GO富集分析-細胞組成

表5 GO富集分析-生物過程

圖5 “柴胡-當歸”藥對治療MGH的KEGG通路

經GO和KEGG通路富集分析發現，“柴胡-當歸”藥對治療MGH的分子功能主要包括細胞因子受體結合、轉錄輔因子結合等；生物過程主要包括活性氧代謝、氧化應激反應等；細胞組分主要包括膜區、細胞質膜筏等；信號通路主要涉及IL-17信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等。

2.7 活性成分-關鍵靶點-關鍵通路網絡構建 綜合閱讀文獻與KEGG分析結果，選出可能與MGH相關的通路，構建活性成分-關鍵靶點-關鍵通路網絡圖，詳見圖6。其中三角形代表關鍵通路，箭頭形狀代表關鍵靶標，六邊形代表活性成分。

圖6 活性成分-關鍵靶標-關鍵通路網絡

由圖6可見，“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生是由多個活性成分、多個靶標及多個通路共同作用的過程。其中，與關鍵通路有關的活性成分有矮牽牛素、山柰酚、槲皮素、3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黃酮等；關鍵靶標有IL-1、EGF、E2F、CCL2、IL-6等；通路主要涉及內分泌耐藥、MAPK信號通路、IL-17信號通路、HIF-1信號通路、TNF信號通路等。

3 討論

本研究通過“活性成分-關鍵靶點-關鍵通路”網絡的構建，獲得與乳腺增生有關的活性成分為槲皮素、山柰酚、矮牽牛素及3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黃酮等。其中槲皮素、山柰酚及3,3″,4″,5,5″,6,7-六甲氧基黃酮均為黃酮類成分，黃酮類化合物具有保護肝臟的效能，還具有類雌激素或抗雌激素作用[11]。雌激素在乳腺增生發展中起到重要的作用，可以通過影響生長因子的合成來促進乳腺細胞增殖，而黃酮類化合物可通過調節雌激素代謝基因的表達，減少雌激素代謝物的產生，如槲皮素可以發揮抗雌激素效應，高濃度時能抑制乳腺上皮細胞存活[12]，從而起到治療乳腺增生的作用。

PPI拓撲學分析結果顯示，AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等靶點度值較大，是“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生潛在核心靶點。AKT1是一種參與細胞存活和細胞周期調控的靶點，乳腺增生的延遲退化與在AKT1中的Thr308位點磷酸化增加有關。數據表明，AKT1還參與調控哺乳期乳腺細胞的生長[13]。TP53位點處于p53基因的內含子中，有穩定基因組、調節轉錄、抑制細胞周期進展、促進凋亡等作用。P53可以通過蛋白降解調控Spy1蛋白的表達，p53的突變或消失會使Spy1水平提高，從而導致乳腺增生[14]。細胞生長增殖需要從血管中獲得營養，乳腺組織增生過度也需新血管生成來供應營養。VEGFA與其受體通過旁分泌途徑協同調節內皮細胞分化和血管生成，刺激血管生成促進腫瘤細胞的生長和轉移，VEGFA的表達隨著增生程度的加重而增加[15]。“柴胡-當歸”藥對可以降低VEGFA的表達，抑制乳腺增生組織新生血管形成，從而治療乳腺增生。炎性因子TNF可以通過降低氧化應激反應相關蛋白8-OHdG和NT的表達，來緩解乳腺增生炎癥和氧化應激反應，“柴胡-當歸”藥對可能是通過調節TNF的表達，增強免疫功能，從而起到緩解乳腺增生的作用[16]。

綜合GO和KEGG分析以及既往研究發現，“柴胡-當歸”藥對可能通過IL-7信號通路、TNF信號通路、內分泌耐藥、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等實現對乳腺增生的治療作用。KEGG通路圖顯示，IL-17信號通路通過NF-κB信號通路、MAPK信號通路調控乳腺增生的治療。IL-17信號通路可以激活NF-κB或者增加IL-6的分泌，發揮其促炎癥作用，使COX-2表達增加，引起組織增生[17]。同時，IL-1β、IL-6、IFN-γ與TNF-α等在MAPK信號通路中通過協同作用在自身免疫性疾病的發病機制中發揮重要作用，可以增強免疫力，起到緩解乳腺增生的效能。TNF信號通路可以通過巨噬細胞分泌的TNF-α影響VEGF的表達，影響乳腺組織新血管的生成，但表達途徑尚不明確；也可能通過泛素-蛋白酶體途徑介導的蛋白水解過程，激活轉錄因子AP-1或者IKβ激酶，激活NF-κB的活性，誘導負性凋亡調節因子，從而促進乳腺組織細胞的增殖。HER2是介導乳腺增生內分泌耐藥的一個重要的生長因子受體，生長因子受體與ER信號通路彼此串話，雙向調節，可以共同刺激乳腺細胞[18]。KEGG分析結果表明PI3K-Akt信號通路與內分泌耐藥有關，有研究證明，通過抑制PI3K或AKT的活性可以增強ER表達，影響內分泌耐藥效果，從而治療乳腺增生[19]。MAPK信號通路可能通過參與內分泌調節、炎癥反應和氧化應激反應來起到治療乳腺增生的效用[20]，主要包括ERK1/2、JNK、P38和ERK5四條通路。MAPK信號通路被證實可以調節雌激素和黃體酮的受體ER和PR[21]，影響乳腺細胞的增殖。ER和HER-2信號通路相互作用，也會激活MAPK信號通路，誘導ER磷酸化，促進乳腺細胞增殖[22]。HIF-1信號通路是一種缺氧適應性信號通路，參與調節細胞凋亡、細胞周期等過程，還可以調控免疫反應、新血管的生成等，增加組織的缺氧耐受力。主要靶點為HIF-1α，低氧時HIF-1α的穩定性會增加。HIF-1通路和其他信號通路的交叉調節對乳腺增生的治療起到很好地效能。缺氧時，細胞內ERK發生磷酸化，促進HIF-1的表達，因而可以推斷MAPK信號通路可以調控HIF-1的表達從而共同治療乳腺增生，但其機制仍需要進一步研究[23]。此外，HIF-1信號通路還與NF-κB介導的炎癥信號通路有一定的相關性，炎癥刺激因子可以通過調控NF-κB介導的炎癥信號通路來增加HIF-1基因和蛋白水平的表達，調節炎癥反應，從而發揮抗乳腺增生的效能[24]。

綜上所述，“柴胡-當歸”藥對可能通過調節AKT1、IL-6、TP53、VEGFA、TNF等核心靶點，參與IL-7信號通路、TNF信號通路、內分泌耐藥、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等途徑，從而調控細胞的氧化應激反應、炎癥反應、抗新血管生成、細胞增殖和凋亡等過程，起到治療乳腺增生的作用。本研究所得結論大部分與現有研究報道相符合，進一步地證明了網絡藥理學與中藥研究的結合，可以挖掘中醫藥治療疾病的作用機制，同時也為中藥研發提供理論支撐。然而，本研究結果只是對“柴胡-當歸”藥對治療乳腺增生作用機制的預測，僅僅停留在生物信息分析層面，具體靶點和通路間的作用機制還需要進一步的實驗去驗證，從而為乳腺增生治療藥物的研發提供方向和依據。