尿液外泌體miR-106a聯(lián)合miR-373診斷前列腺癌的價值

唐鵬 沈利楊 張哲偉 王爾平 尤小明 葉鏗

前列腺癌是前列腺腺泡細(xì)胞無序生長而產(chǎn)生的疾病，是男性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率均位于男性腫瘤前列［1］。前列腺癌具有隱匿性，多數(shù)確診時已處于中晚期，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全。前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）是目前廣泛使用的前列腺癌標(biāo)志物，但其特異性差，患者一般需要進(jìn)行穿刺活檢。因此，尋找更為敏感、特異的指標(biāo)刻不容緩。外泌體是機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞分泌的微小囊泡，腫瘤來源的外泌體攜帶蛋白質(zhì)、微小RNA（microRNA，miRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）和脂質(zhì)等多種生物活性分子，通過多種途徑參與腫瘤進(jìn)展［2］。miRNA對轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)起調(diào)控作用，且在細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡和代謝過程中發(fā)揮重要作用［3］。微小RNA-106a（microRNA-106a，miR-106a）在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，影響腫瘤增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為［4］。微小RNA-373（microRNA-373，miR-373）在不同腫瘤中發(fā)揮著致癌或抑癌作用，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖等生物學(xué)行為密切相關(guān)［5］。但miR-106a和miR-373在前列腺癌中的作用少有報道，本研究旨在探索尿液外泌體中miR-106a、miR-373對前列腺癌的診斷價值，以期為前列腺癌的早期診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年11月至2018年4月在本院就診的前列腺癌患者69例作為觀察組，年齡43～76（57.14±9.32）歲。另選取同期在本院進(jìn)行常規(guī)體檢的健康男性69例作為對照組，年齡42～74（54.67±10.73）歲。兩組的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次診斷為前列腺癌；②經(jīng)前列腺穿刺病理確診；③未進(jìn)行激素治療、放療、化療和手術(shù)治療者；④患者或家屬簽署知情同意書。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤者；②合并有糖尿病、冠心病、高血壓等疾病者；③合并有肝、腎等臟器疾病者；④自身免疫疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 ExoQuick-TC for Tissue Culture Media and Urine（貨 號：EXOTC10A-1），購 自 美 國System Bioscience公司；RNA提取試劑盒（貨號：12183025），購自北京天根生化有限公司；Prime Script? RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號：RR037A）、PrimeScript?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：6210A），均購自日本TaKaRa公司；實(shí)時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）儀（型號：7500），購自美國Bio-Rad公司。

1.3 研究方法 （1）樣品采集及處理：①采集所有受試者的晨尿20 mL，室溫下以8,000 r/min離心20 min，除去細(xì)胞碎片和沉渣，收集上清液，取10 mL樣本加入2 mL ExoQuick試劑充分混勻，4 ℃靜置過夜，3,000 r/min離心30 min，棄去上清液，繼續(xù)2,000 r/min離心5 min，棄去上清液，所得沉淀即為尿液外泌體。②采集所有受試者空腹靜脈血3 mL，離心并分離血清，保存于-80 ℃冰箱待測。（2）qRT-PCR測定miR-106a、miR-373的表達(dá)量：提取尿液外泌體總RNA，嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒說明書操作，檢測RNA純度及其完整度。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：所得RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。qRT-PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系20μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1 μL，H2O 7μL，每個待測樣本設(shè)置3次平行，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，均以U6為內(nèi)參，見表1。反應(yīng)條件：95 ℃反應(yīng)30 s，95 ℃反應(yīng)10 s、60 ℃反應(yīng)30 s、35個循環(huán)，qPCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。使用ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行相對定量分析，根據(jù)各樣本的平均Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-106a和miR-373的相對表達(dá)量。（3）血清PSA水平檢測：采用化學(xué)發(fā)光免疫法，其中以PSA=4 ng/mL為鑒別前列腺癌的臨界值，PSA≤4 ng/mL者判定為陰性，PSA>4 ng/mL者判定為陽性［6］。

表1 miR-106a、miR-373及內(nèi)參基因U6的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以［n（%）］表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特性曲線（ROC），分析尿液外泌體中miR-106a、miR-373對前列腺癌的診斷價值；采用四格表分析miR-106a聯(lián)合miR-373對前列腺癌的診斷價值，分別設(shè)a 真陽性、b 假陽性、c 假陰性、d 真陰性，靈敏度=a/（a+c），特異度=d/（b+d）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組尿液外泌體中miR-106a、miR-373的表達(dá)情況 觀察組尿液外泌體中miR-106a、miR-373的表達(dá)量均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組尿液外泌體中miR-106a、miR-373的表達(dá)水平比較［（±s），n=69］

表2 兩組尿液外泌體中miR-106a、miR-373的表達(dá)水平比較［（±s），n=69］

組別 miR-106a miR-373對照組 3.36±0.82 3.53±1.03觀察組 2.25±0.63 2.46±0.76 t值 8.917 12.005 P值 <0.001 <0.001

2.2 前列腺癌患者miR-106a、miR-373表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)觀察組miR-106a、miR-373表達(dá)水平的中位值分別將其分為兩組，其中miR-106a低表達(dá)39例，高表達(dá)30例；miR-373低表達(dá)42例，高表達(dá)27例。前列腺癌患者尿液外泌體中miR-106a和miR-373的表達(dá)水平與年齡、病理分級無關(guān)（P>0.05）；miR-106a和miR-373的表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05）。見表3。

表3 前列腺癌患者miR-106a和miR-373表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］

2.3 尿液外泌體miR-106a、miR-373水平單獨(dú)檢測診斷前列腺癌的效能比較 結(jié)果顯示，尿液外泌體miR-106a、miR-373水平診斷前列腺癌的AUC分別為0.852、0.821，靈敏度分別為82.6%、72.5%，特異度分別為72.5%、78.3%。見圖1-2。

圖1 尿液外泌體miR-106a水平對前列腺癌的診斷價值

2.4 血清PSA水平、尿液外泌體miR-106a聯(lián)合miR-373檢測對前列腺癌的診斷價值比較 血清PSA診斷前列腺癌的靈敏度為94.2%，特異度為26.1%。將尿液外泌體miR-106a或miR-373檢測前列腺癌陽性規(guī)定為聯(lián)合診斷陽性。尿液外泌體miR-106a聯(lián)合miR-373診斷前列腺癌靈敏度為92.8%，特異度為72.5%。見表4。

表4 血清PSA、尿液外泌體miR-106a聯(lián)合miR-373檢出前列腺癌的四表格

圖2 尿液外泌體miR-373水平對前列腺癌的診斷價值

3 討論

外泌體是由多種細(xì)胞釋放的雙層脂質(zhì)膜囊泡，直徑約30～100 nm，在血液、尿液、唾液、乳汁等體液中廣泛存在［7］。研究發(fā)現(xiàn)，在多種生物的外泌體中已鑒定出四萬余種蛋白質(zhì)、三千余種mRNA、兩千余種miRNA和一千余種脂質(zhì)［8］。外泌體在多種疾病及惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用，能夠參與細(xì)胞生長、遷移和腫瘤中血管生成等生理過程［9］。miRNA是長度在20～24 nt之間小型非編碼單鏈RNA，可靶向結(jié)合mRNA3’端非編碼區(qū)，調(diào)節(jié)目的基因蛋白的表達(dá)，從而在細(xì)胞增殖、分化、侵襲和凋亡等過程中發(fā)揮作用。近年來，miRNA在腫瘤中的異常表達(dá)受到廣泛關(guān)注，成為腫瘤診斷生物標(biāo)志物的研究熱點(diǎn)，然而RNA極易被降解，給研究帶來一定的困難。但外泌體能夠保護(hù)體外RNA不被降解，并發(fā)揮載體作用，將RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的靶細(xì)胞，從而調(diào)控細(xì)胞的生理活動［10］。FOJ等［11］研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌患者尿液外泌體中miR-21、miR-141、miR-375表達(dá)呈上升趨勢，miR-214表達(dá)呈下降趨勢，顯示多種miRNA在前列腺癌中異常表達(dá)。

miR-106a是miR-17家族成員，由23個核苷酸組成，位于人染色體Xq26.2處，對多個癌基因及其相關(guān)蛋白具有調(diào)控作用，在多種腫瘤中表達(dá)異常，起致癌基因或抑癌基因的作用。ZHU等［12］研究顯示，miR-106a在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，參與癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。BULLOCK等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ期結(jié)直腸癌患者組織中miR-106a高表達(dá)，能夠預(yù)測患者的無病生存期和總體生存期。miR-373是miRNAs-371-372-373家族成員，位于人染色體19q13.42處，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、衰老和凋亡等生物學(xué)過程，在不同腫瘤中發(fā)揮致癌或促癌的作用。研究表明，miR-373在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，起促癌作用［14］；在卵巢癌、膀胱癌中能抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，起抑癌作用［15-16］。

本研究檢測前列腺癌患者尿液外泌體中miR-106a和miR-373的表達(dá)水平，結(jié)果顯示觀察組miR-106a、miR-373的表達(dá)均明顯低于對照組，且二者的表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-106a和miR-373可能參與前列腺癌的細(xì)胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移等過程，從而影響前列腺癌的疾病進(jìn)程。進(jìn)一步依據(jù)前列腺癌患者尿液外泌體中miR-106a和miR-373水平分別繪制ROC曲線，AUC分別為0.852、0.821，靈敏度分別為82.6%、72.5%，特異度分別為72.5%、78.3%，說明miR-106a和miR-373水平均可在一定程度上診斷前列腺癌。miR-106a聯(lián)合miR-373診斷前列腺癌的靈敏度為92.8%，顯著高于單獨(dú)檢測的靈敏度，特異度為72.5%，提示miR-106a聯(lián)合miR-373檢測可提高對前列腺癌診斷的靈敏度。

綜上所述，miR-106a聯(lián)合miR-373診斷前列腺癌的靈敏度、特異度均較高，具有一定的臨床價值。但本研究的樣本量較少，結(jié)果可能有局限性，尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。