PDMS微孔陣列細胞培養實驗平臺的初步構建與評測

何懿 欒杰

PDMS微孔陣列細胞培養實驗平臺的初步構建與評測

何懿 欒杰

目的 應用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）為微孔支架材料制備微陣列細胞培養試驗平臺，對大鼠脂肪干細胞(ADSCs)在不同孔徑微陣列中的貼附能力進行研究。方法 采用PDMS為微孔支架材料，制備20 μm、40 μm、60 μm和80 μm不同孔徑微陣列，將大鼠ADSC單細胞接種其上，分別對各組中細胞的貼附能力及形態進行觀察及檢測。結果 硅晶圓模板經酸性雙氧水清洗倒模后形成的PDMS微陣列支架基本符合設計要求；ADSCs直接種植在未經預處理的支架上時，細胞貼附能力明顯下降；而經10%胎牛血清（FBS）培養基完全浸泡預處理后，細胞在PDMS表面的貼附及存活能力提高；體外培養120 h時，不同孔徑的微孔內細胞生長總數具有顯著性差異。結論 在PDMS材料上可以制作適合于大鼠ADSCs生長的不同直徑的微孔陣列。

微孔陣列 微尺度技術 聚二甲基硅氧烷

組織工程技術發展迅速，但是目前還存在著許多需要解決的問題，如細胞純化、種子細胞體外培養后生物學性狀改變、天然或人工支架材料三維結構難以精細控制以及支架內種子細胞生物學特性檢測手段不力等問題，這些問題限制了組織工程研究的進一步發展及臨床應用的推廣。

微尺度技術（Microscale technologies）為解決上述問題提供了新的思路。該技術是在1 μm～1 mm尺度范圍內進行工程設計、制備和分析的新技術[1]。利用微尺度技術加工的微孔陣列（Micro-well arrays）可以在不同材料（玻璃、硅、PDMS、PLGA等）表面生成大量（每平方厘米內有數百至數千個）微孔，微孔的形態、排列及密度可根據實驗內容而異。將微孔陣列應用于組織工程及細胞生物學研究，將具有前所未有的潛力，是解決諸多難題的潛在的有力工具[2]。更為重要的是，微孔陣列不僅能滿足高通量檢驗的需求，尤其適用于數量少、來源寶貴的干細胞研究[3]。

本實驗利用微陣列技術，采用聚二甲基硅氧烷（Polydimethyl-siloxane，PDMS）為微孔支架材料，對大鼠脂肪干細胞（ADSCs）在不同孔徑微陣列中的貼附能力進行研究，以期驗證微孔陣列這一新興實驗平臺在干細胞研究中的可行性，同時初步明確細胞在微孔陣列三維培養平臺上的細胞生物學特點，為干細胞組織工程的深入研究打下基礎。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗設備及材料

光刻機：德國Karl Suss公司MA6/BA6型，波長為紫外光（i線）356 nm；臺階儀：KLA-Tencor P-6；電感應耦合等離子體（Inductively Coupled Plasma，ICP）；刻蝕機：Alcatel 601E-D 型；刻蝕氣體：C4F8和SF6。 聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）：Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit（Dow Corning，USA）。

1.2 光刻掩膜加工及光刻流程

1.2.1 掩膜設計及加工

依照圖1樣式設計硅晶圓加工前的掩膜。所設計圖形每片面積1 cm2，內有約6 800～6 900個微孔。

采用步進機（Stepper）刻畫，激光束直接在涂有鉻層的5''玻璃板上刻畫，邊緣起點5 mm。用步進機重復將掩膜原版（Reticle mask）比例縮小到master mask上，應用到實際曝光中的為工作掩膜（Working mask），工作掩膜由master mask復制而來。

圖1 微孔陣列光刻掩膜設計Fig.1 The photolithography mask design of microwell arrays

1.2.2 光刻流程

硅晶圓表面經清潔、干燥后，均勻涂布光刻膠并加熱使其部分蒸發。上光刻機后將掩膜板和圖形在涂布光刻膠的硅晶圓上精準對焦后曝光。利用有機溶劑去除非聚合光刻膠，加熱，繼續蒸發溶劑。經檢查表面對準良好、無明確缺陷后，將晶圓頂層沒有光刻膠保護的開放部位刻蝕去除，刻蝕深度控制在20～30 μm范圍。隨后溶解光刻膠，檢查晶圓表面結構規整程度及是否存在加工缺陷。清洗，烘干，裝盒備用（圖2）。

1.3 PDMS模板的生成與加工

1.3.1 硅晶圓的清洗

采用雙氧水體系清洗，除去原子、離子等不可見污染。將經過光刻、帶有陣列結構的硅晶圓完全浸沒于成分比為 H2SO4（98%）∶H2O2（10%）=5∶1（或 4∶1）的酸性液中清洗，將硅晶圓表面的有機物分解去除。隨后，用超純水沖洗后，再用成分比為 H2O∶H2O2∶NH4OH為 5∶2∶1（或 5∶1∶1，或 7∶2∶1）的堿性清洗液清洗，使金屬離子形成可溶性絡合物而溶于水。然后，使用成分比為 H2O∶H2O2∶HCL=7∶2∶1（或 5∶2∶1）的酸性清洗液，使金屬微粒生成溶于水的絡合離子，從而達到清洗目的。

1.3.2 硅晶圓表面處理

在澆注PDMS前用氟硅烷試劑對模板表面熏蒸120 min，也可將經過超聲清洗后的硅晶圓浸泡于含有5%油污洗滌劑的去離子水溶液中，使微孔板表面黏附上一層稀薄的洗滌劑成分薄膜。隨后圖形面向上放置于烘箱內80℃烘干，經PDMS澆筑后，發現可以有效減少脫模張力，保護硅晶圓表面結構。

1.3.3 PDMS微孔板的形成

本實驗選用硅橡膠預聚物Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit(Dow Corning，USA)，由液體 A、B 兩組分組成，可按10∶1重量比混合為中等黏度的混合液，具體實驗流程如下：①取彈性模板材料PDMS前驅物A組分（基本組分）10 g至玻璃培養皿內。②按質量比10∶1加入B組分（固化劑）1 g充分混合均勻，放入真空干燥罐中負壓抽吸30 min，去除因攪拌產生的氣泡。③將混合好的PDMS混合液傾倒于硅晶圓表面，水平放置于真空條件下保持負壓抽吸1 h，去除殘留的氣泡。隨后水平置入鼓風干燥箱80℃烘烤2 h，固化后剝離得到表面復制精細圖形的彈性模板。④將圖形轉移后的PDMS板用手術刀沿微孔區域間的分割線切割，將切割好的微孔板圖形面朝下置于盛有95%乙醇的大燒杯中，后置于水平搖床上以100 r/min的速度晃動清洗，之后用去離子水將殘留的乙醇沖洗干凈，將微孔板表面朝下水平浸入盛有去離子水的超聲清洗儀液面下，超聲清洗8 min，共3次；然后，依據微孔不同孔徑分裝于玻璃培養皿內。⑤消毒采用乙醇浸泡法或高溫高壓消毒法。

如采用乙醇浸泡法，可直接將清洗好的微孔板依照實驗設計分裝于塑料培養皿內，使75%乙醇完全浸泡微孔板，根據揮發量每24 h補充一次乙醇。實驗前24 h停止添加乙醇，打開培養皿，置于通風櫥或生物安全柜中，紫外光照射，待其自然揮發干燥后封口備用。

如采用高溫高壓消毒法，可將切割為1 cm2的小塊分裝于不同玻璃培養皿內。將分裝好的PDMS微孔板進行高溫高壓消毒。消毒后再于生物安全柜中將微孔板分裝于滅菌塑料培養皿內，待其干燥后封口備用。

1.3.4 PDMS微孔板掃描電鏡計量

倒模后形成的PDMS微孔板經噴金后行掃描電鏡觀察，分別測量 20 μm、40 μm、60 μm 和 80 μm孔的直徑，以20 μm口徑微孔板為例，誤差率小于5%（圖3），滿足實驗設計需要。

圖3 20 μm微孔精度測量（掃描電鏡，1 000×）Fig.3 The measurement of 20 μm pore precision(SEM,1 000×)

1.4 實驗分組

經預實驗發現，對于大鼠ADSCs而言，20 μm孔徑過小，細胞很難進入，故將其翻轉180°，取其背面平坦表面為空白對照。

經預實驗篩選，接種細胞濃度在5×105cells/L時，可使一個細胞占據單個微孔的比例最高。

1.4.1 分組一

為檢驗PDMS的生物安全性，設計將純平面空白板共20塊浸泡于含10%FBS的DMEM培養基中，根據浸泡時間設計A、B、C、D、E和F共6組，每組 4板，分別為未浸泡組及浸泡 24 h、48 h、72 h、96 h和120 h組。

1.4.2 分組二

將消毒的PDMS微孔板在生物安全柜內分裝于培養皿內，每一皿中分別包含空白板、40 μm、60 μm和80 μm各1片，共6皿。分裝后將微孔板浸泡于含10%FBS的DMEM培養基中72 h（圖4）。

圖4 4種PDMS微孔板用含10%FBS的DMEM浸泡Fig.4 Four kinds of PDMS micro-well plates immersed in 10%FBS DMEM medium

1.5 大鼠ADSCs的分離與培養

于無菌條件下切取400 g左右成年雄性SD大鼠腹股溝區脂肪墊，用組織剪剪碎后放入0.12%Ⅰ型膠原酶溶液中，于37℃下水平搖床（120 r/min）震蕩1 h，然后加入等量的10%胎牛血清、1%青鏈霉素及DMEM培養基以中和膠原酶。消化后的細胞懸液離心后重懸至上述培養基中，并經100 μm細胞篩過濾，過濾后的細胞懸液接種在100 mm2培養皿中，24～48 h后換液，待細胞進入對數生長期，胰酶消化后與不含抗生素的10%FBS培養基混勻接種于六孔板中待轉染。取一部分原代培養的細胞接種于六孔板中，用于成骨及成脂誘導鑒定。

1.5.1 ADSCs的成脂誘導及成脂分化鑒定

ADSCs經胰酶消化后以1×105個/孔的密度接種到六孔板中，細胞貼壁后換用成脂誘導培養基（1 μM dexamethasone，0.5 mM IBMX，200 μM indomethacin，10 μM Insulin）隔日換液至誘導后 10 d。

細胞爬片以含鈣福爾馬林固定15 min，水洗后60%異丙醇孵育2 min，油紅O染色30 min，70%乙醇分色1～2 min，鏡下控制染色時間。

1.5.2 ADSCs的成骨誘導及成骨分化鑒定

ADSCs經胰酶消化后以1×105個/孔的密度接種到六孔板中，細胞貼壁后換用骨誘導培養基（50 μM ascorbate-2-phosphate，10 mM β-磷酸甘油及 0.01 μM 1,25-dihydroxyvitamin）。另一組細胞換用正常培養基作為對照，成骨誘導持續4周。

1.5.2.1 茜素紅染色

細胞爬片以95%乙醇固定10 min，水洗后放入0.1%茜素紅染料中37℃孵育30 min。

1.5.2.2 堿性磷酸酶染色

細胞爬片以檸檬酸丙酮緩沖液固定30 sec，并使用 Naphthol/Fast blue染料 （Sigma-Aldrich Kit 85L2-1KT，USA）染色 30 min，蘇木素復染 3 min。

1.5.2.3 骨鈣素免疫組化染色

細胞爬片10 mM（pH 6.0）檸檬酸鈉緩沖液中熱修復20 min，5 μg/mL羊抗鼠骨鈣素一抗和Avidin-HRP Kit（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）按試劑盒說明進行染色。

1.6 大鼠ADSCs的種植

1.6.1 分組一

在24塊空白板表面種植5×105cells/L濃度的大鼠ADSCs，滴懸液100 μL，以略少于微孔板數量的密度進行種植。在高倍鏡（40×）下對50個獨立視野進行拍照，計量種植后 4 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h等不同時間點板載細胞數，取所得細胞數量平均值繪圖。戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

1.6.2 分組二

4種不同微孔板表面種植大鼠ADSCs，以濃度5×105cells/L的滴懸液100 μL種植于微孔板表面，并以相同濃度細胞懸液400 μL在普通培養皿內種植。 于種植后 1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和 7 d 在高倍鏡下對50個獨立視野拍照，計量普通培養皿表面、空白組表面和不同孔徑微孔內細胞數量變化，取細胞數量平均值繪圖。戊二醛固定，掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 大鼠ADSCs培養

細胞于誘導開始后即停止分裂增殖，由長梭形變成不規則的圓形，體積增大，大小不一。最早于誘導后4 d即可在細胞內看到小脂滴，脂滴逐漸增多，有的融合形成較大的脂滴。誘導14 d時細胞分化達到高峰，經油紅O染色證實為脂滴（圖5）。

圖5 大鼠ADSCs成脂誘導10 d（油紅O染色，光鏡，40×）Fig.5 Rat ADSCs adipogenic for 10 days(Oil red O staining,40×)

圖6 大鼠ADSCs成骨誘導4周（茜素紅染色，光鏡，40×）Fig.6 Rat ADSCs osteogenic for 4 weeks(Alizarin red staining,40×)

體外傳2代后，換骨誘導培養基培養，細胞由長梭型成纖維細胞樣逐漸變為圓形及多角形，細胞間相互聚集成結節狀，誘導4周后有大團骨結節形成。骨結節的結構在茜素紅染色中顯示較強的紅色（圖6）；堿性磷酸酶染色顯示，經誘導的ADSCs尤其是骨結節形成區域附近，有明顯的堿性磷酸酶活性升高表現（圖7）。骨鈣素免疫組織化學染色顯示，經誘導的ADSCs呈陽性表現，尤以細胞核和骨結節區域更明顯（圖8）。未誘導組均未發現上述陽性結果。

圖7 大鼠ADSCs成骨誘導4周（堿性磷酸酶染色，光鏡，200×）Fig.7 Rat ADSCs osteogenic for 4 weeks(Alkaline phosphatase staining,200×)

圖8 大鼠ADSCs成骨誘導4周（骨鈣素免疫組化染色，光鏡，40×）Fig.8 Rat ADSCs osteogenic for 4 weeks(Immunohistochemical staining of osteocalcin,40×)

本研究利用原代細胞培養技術從大鼠脂肪組織中分離出ADSCs進行體外培養，可以進行成脂、成骨分化，具有多向分化潛能。經初步鑒定，證實其為ADSCs。

2.2 實驗一部分

未經培養液預處理的PDMS空白板，種植細胞后細胞存活天數明顯少于正常培養皿內的細胞。PDMS空白板浸泡于含10%FBS的DMEM培養基內的時間越長，細胞存活數量越多（圖9）。細胞于浸泡達72 h的空白板表面穩定生長，數量增殖不明顯。同時，繼續延長浸泡時間對于細胞數量的增加并無明顯作用（圖10）。

圖9 含10%FBS的DMEM培養基浸泡時間不同對PDMS板載細胞數量的影響Fig.9 The cell numbers of PDMS plates that immersed in DMEM medium containing 10%FBS for different times

圖10 含10%FBS的DMEM培養基浸泡72 h不同平面細胞存活數量的比較Fig.10 The cell numbers of different kinds of PDMS plates immersed in DMEM medium containing 10%FBS for 72 h

掃描電鏡觀察，對照組細胞體積差異較大，形態不均一。細胞呈梭形、多角形爬附于PDMS表面。隨著培養時間的延長，鄰近細胞間接觸增多，可見細胞間的交叉、堆疊（圖11）。

2.3 實驗二部分

根據細胞數量繪制生長曲線，普通培養皿培養的細胞可見平臺期、對數生長期，細胞增殖曲線呈“S”型。

PDMS空白組并未出現普通培養皿的增殖曲線，且其數量隨時間延長而少量增加。細胞形態改變同實驗一。

不同微孔板間，僅40 μm孔徑組細胞數量較其他各組有所增加。同60 μm組和80 μm組相比，40 μm組細胞增殖更明顯（P＜0.05）。因受微孔空間限制，細胞不會鋪滿生長區域，ADSCs在具有微孔結構的PDMS板上會依據微孔形態、大小貼附后生長，并在微孔內伸出偽足狀結構（圖12），細胞所能延展的大小完全受微孔尺寸限制。

圖11 大鼠ADSCs在PDMS表面培養72 h（掃描電鏡，1 000×）Fig.11 ADSCs cultured on PDMS surface for 72 h(SEM,1 000×)

圖12 大鼠ADSCs在PDMS表面培養96 h（掃描電鏡，1 000×）Fig.12 ADSCs cultured on PDMS surface for 96 h(SEM,1 000×)

3 討論

3.1 微孔陣列技術

3.1.1 微孔陣列技術應用于組織工程領域的必要性三維空間物理因素對細胞生長、發育存在影響已經越來越被學者所認同。傳統組織工程技術通常先在平面培養皿內培養擴增種子細胞，再將細胞接種于支架植入實驗動物體內以觀察支架細胞復合體的治療效果。這種方法存在很多無法克服的缺點：①經分離培養后的細胞，仍不能做到完全的純化，接種于支架內的細胞常常是混雜的多種細胞，某些獨立細胞系的真實狀態被這種混雜狀態所掩蓋；②種子細胞在體外普通平面培養過程中其生長環境較體內發生了巨大改變，其相應的生物學性狀也極有可能發生了改變，對于其接種并植入體內后的生物學行為造成的影響無法估量；③現有的支架材料，無論是天然的還是人工的，其內部空間結構大多復雜、不規整，其立體三維結構很難嚴格控制，對種子細胞的生物學行為也存在無法預測的影響；④細胞接種支架后，其生物學行為大部分只能應用組織切片方法才能觀察。而組織切片過程可能造成支架、細胞結構破壞或移位，無法實現100%的真實還原。以上缺點導致實驗者無法確定是什么樣的細胞生長于什么樣的空間環境中，而細胞的生長狀態如何也不得而知，使得組織工程的研究應用缺乏嚴謹、科學的細胞學基礎。

微尺度技術是在1 μm～1 mm尺度范圍內進行工程設計、制備和分析的新技術。利用微尺度技術加工的微孔陣列可以在不同材料（玻璃、硅、PDMS、PLGA等）表面生成大量（每平方厘米內有數百至數千個）微孔。將微孔陣列應用于組織工程及細胞生物學研究領域，是解決這一領域諸多難題的潛在有力工具[2]，隨著軟印模技術和光刻技術的不斷發展，使得微孔陣列也越來越多地應用于生物醫學的研究中。

本實驗中，為保證單位面積（1 cm2）內微孔數量恒定，將各孔的水平排列設計為斜60°，將此陣列各微孔中心點間距固定為120 μm，即各孔間排列為正三角形（圖13），孔間距在各方向上保持基本相等。

圖13 不同孔徑PDMS微孔透光性觀察（光鏡，100×）Fig.13 The translucent observation of different size of PDMS micro-well plates(optical microscopy,100×)

3.2 PDMS生物安全性

PDMS是一種透明（透光率可達100%，圖11）、安全無毒、生物相容性好的彈性材料，廣泛應用于絕緣、潤滑、防水、防震和防油塵領域，可直接應用于組織工程支架的構建[3]。PDMS具有生理惰性、良好的化學穩定性、電絕緣性，其耐熱性、耐寒性好，黏度隨溫度變化小。其表面張力小，并具有很高的抗剪切能力，可在-50～200℃下長期使用。以PDMS為材質的微孔陣列具備良好的物理化學屬性[3]。

3.3 硅晶圓清洗及預處理

3.3.1 硅晶圓清洗

采用雙氧水體系清洗效果好，環境污染小，可將硅晶圓表面的有機物、金屬離子、微粒徹底清除。圖14為未經清洗倒模的PDMS板（A）和經過清洗后倒模的PDMS板（B），若不清洗會造成倒模生成的PDMS表面殘留過多的雜質微粒，影響實驗結果。

圖14 硅模板清洗前后倒模生成PDMS微孔板對比（光鏡，40×）Fig.14 The comparison of PDMS micro-well plates generated from silicon master before(A)and after(B)cleaning (optical microscopy,40×)

3.3.2 硅晶圓表面預處理

在預實驗中，我們發現表面脫模不良可以導致PDMS板撕裂、硅模板微柱斷裂，尤其是PDMS用量較大、微孔板較厚、固化劑添加比例偏多時更為嚴重（圖15），硅晶圓表面的微柱結構可因脫模時的成角剪切力而斷裂。故此，添加脫模劑或進行表面硅烷化處理對于保護硅模板和新形成的PDMS微孔板同樣重要。

圖15 微孔結構破壞Fig.15 The destruction of microporous structure

我們將經過超聲清洗后的硅晶圓浸泡于含有5%油污洗滌劑的去離子水溶液中，使微孔板表面黏附上一層稀薄的洗滌劑成分薄膜。隨后圖形面向上放置于烘箱內80℃烘干，經PDMS澆筑后發現此法也可有效減少脫模張力，保護硅晶圓表面結構。

3.4 PDMS加工、清洗及預處理

3.4.1 PDMS微孔板加工注意事項

本實驗選用的硅橡膠預聚物Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit（Dow Corning，USA），由液體 A、B組分組成的套件產品，包括基本組分與固化劑。無論厚薄，混合液將固化成為具有韌性的透明彈性體。此產品為A、B劑混合硅膠，按10∶1重量比混合為中等粘度的稠度混合液。

Sylgard 184的固化反應起始于混合過程的開始，其適用期隨溫度增高而縮短（適用期的定義為基本組分與固化劑混合后，黏度增至原來的兩倍所需的時間）。起初的固化現象是黏度逐步增加，接著開始出現凝膠，然后轉變為彈性固體。溫度會對固化時間產生明顯影響（材料用量大者需要適當延長固化時間），室溫下固化時間大于48 h，100℃約需35 min，125℃約需20 min，150℃約需10 min。

使用此材料時（未固化）前，不可接觸到胺類（如環氧樹脂），硫化物（如PU）及不飽和碳氫塑料（如PVC），否則會抑制此材料的固化反應，造成永久黏連、不固化。在預實驗階段，配制PDMS混合液時曾使用PVC塑料棒攪拌，導致室溫下固化48 h不能完全固化，即使經過100℃加熱固化仍存在拉絲、黏連等不凝固現象。這種不完全固化不僅會造成脫模困難，更為嚴重的是，可能在硅晶圓模板表面殘留不凝固PDMS成分，最終影響重復倒模的精確度。

3.4.2 PDMS板的清洗及再利用

光刻形成的硅晶圓模板表面經過清洗后，澆筑脫氣泡的PDMS，經熱固化后剝離可生成符合設計要求的微孔板，可以直接用于細胞培養（圖12）。利用這種方法加工所得的微孔陣列，精度高、表面質量好，制作效率高，原材料的利用率接近100%[4]。

硅晶圓經過清洗，表面雜質、微粒已大大減少，但為保證實驗精確、安全，推薦于實驗分皿前用乙醇容積震蕩、超聲波等清洗方法徹底去除表面雜質。

使用過的PDMS板，也可使用胰酶將表面殘留細胞、碎片清除，然后經上述方法清洗、消毒后，微孔板還可以重復使用。

3.4.3 PDMS表面預處理

根據Charnley等[3]的研究報告，PDMS疏水性強，且對培養介質內的蛋白成分（如生長因子）有較強的吸附作用，會影響正常細胞的生長繁殖。故在隨后的實驗設計中改進支架處理工藝，將支架浸泡于培養液內一段時間，可明顯提高細胞在PDMS表面的存活時間。但是，對于爬附能力低或未貼壁的細胞，則有可能從PDMS表面脫落。此外，在培養過程中的搬運、晃動、換液沖刷等也可導致未貼附緊密的細胞從PDMS表面脫落。

有學者利用氧等離子處理PDMS和玻璃表面，再經培養液浸泡過夜后其表面親水性在培養液浸泡前后存在明顯差異，經培養液浸泡的兩種材料表面親水性都大大增加，蛋白質的吸附為增加表面親水性的原因[5]。有一點需要特別指出，細胞在微孔陣列中的生長遠遠不同于常規培養，主要原因是微孔結構提供了與常規培養不同的生長微環境[6]。細胞增殖到平臺期時并沒有鋪滿生長區域，我們估計原因是隨著細胞數目增多，微孔內培養溶液體積相對變小，使得營養供應不充分；并且較多的細胞代謝產物累積在周圍，形成了一個不利于細胞生長的微環境，導致細胞生長停滯。

3.5 PDMS表面及微孔內細胞生物學表現

PDMS材料會吸附蛋白質，若不進行表面處理則無法直接用作細胞培養。經過含血清培養基浸泡處理后的PDMS表面具備基本的細胞黏附、生長條件，基本滿足細胞培養的需要，可以作為細胞學研究的實驗平臺。PDMS表面細胞增殖數量低于普通培養皿表面，應該同PDMS的蛋白吸附作用有關。

細胞在微孔陣列中的生長遠遠不同于常規培養，主要原因是微孔結構提供了與常規培養不同的生長微環境[7]，微孔的立面結構給細胞提供了很好的空間依附，在這樣的空間結構幫助下，細胞有兩個面與材料表面接觸，能夠更穩定地在PDMS表面生長。

掉落于微孔內的細胞并未出現大量增殖，可能與微孔結構圍成的小環境有關。細胞貼附于PDMS表面后，必須保證自身在PDMS材料上的良好貼附才能有所生長。若微孔結構過大（60 μm、80 μm），就接近平面培養，雖可以與鄰近微孔立面接觸，但仍需要伸展到較大面積方可完成穩定爬附。小一些的微孔結構（40 μm），對于細胞而言，并不需要延展就可與多個立面接觸，故此爬附面積小，也就形成了填滿微孔的現象。因此我們認為，當微孔直徑與參與實驗的細胞大小相適宜時，細胞的生長比較穩定。

微孔內的細胞較普通平面培養的細胞增殖減少。我們認為這種空間結構對細胞增殖、生長存在抑制作用。這種抑制應屬于一種比較“溫柔”的抑制，更接近于細胞在體內準備階段的生活狀態。過度生長旺盛的細胞并不能代表這種細胞的真實生理狀態。故此，40 μm孔徑的微孔內細胞生長能夠實現穩中有升，應該與其內部容積接近大鼠脂肪干細胞的平均體積有關。

4 結論

利用微加工技術可以在PDMS材料上制備適合于大鼠ADSCs生長的不同直徑的微孔結構。微孔陣列實驗平臺可以根據實驗設計的不同進行精細調整，更精確地研究具體的科學問題。本實驗中硅晶圓模板經酸性雙氧水清洗、倒模后形成的PDMS微陣列，表面結構精細，基本符合設計要求。

細胞直接種植在未經預處理的支架上時細胞貼附能力明顯下降，而經10%FBS培養基完全浸泡預處理后，細胞在PDMS表面的貼附及存活能力提高。

體外培養120 h時，其他條件保持恒定，不同孔徑（40 μm、60 μm、80 μm）的微孔內細胞生長總數具有顯著性差異，40μm微孔較60μm和80μm微孔更適宜細胞生長，證明不同孔徑微孔對大鼠ADSCs生長存在影響。

光刻和軟印模技術的廣泛應用、不斷成熟，使得微孔陣列技術成為組織工程學的有力工具。但利用微孔陣列平臺進行細胞生物學實驗，仍須注意生物材料的選擇及表面處理方法等對細胞活性的影響。因此，在實驗中必須仔細研究材料對細胞活動的影響，才能根據不同的實驗方法選擇適宜平臺制作的材料和操作方法，從而得到可靠的實驗結果。

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The Initial Construction and Evaluation of PDMS Porous Array Platform for Cell Culture Experiments

HE Yi,LUAN Jie.Department of Plastic and Reconstructive Surgery of the Breast,Plastic Surgery Hospital of CAMS,Beijing 100144,China.

LUAN Jie(E-mail：doctorluan@hotmail.com).

ObjectiveTo establish a cell culture platform by using PDMS (Polydimethylsiloxane,PDMS)as porous scaffold materials and to test the attachment rate of rat adipose-derived stem cells(ADSCs)on different aperture microarray.MethodsThe micro-well arrays plates were designed by using PDMS (Polydimethylsiloxane,PDMS) porous scaffold materials at 20 μm,40 μm,60 μm and 80 μm pore sizes respectively.The single rat ADSC was inoculated on it.The morphology was observed and the attachment rate of cells were detached in each group.ResultsThe reverse mould pretreated PDMS microarray stent meets the requirements of the experiment after acid hydrogen peroxide washing;The cell attachment rate decreased significantly when the cells were planted directly on the stent without pretreatment while the cell attachment and survival rate increased significantly when the cells were planted on the stent pretreated by 10%FBS(Fetal bovine serum);There are significant differences of the total cell number between the different porous aperture at 120 h in vitro.ConclusionVarious diameter micro-well arrays could be produced on the surface of PDMS to facilitate the growth of rat ADSCs.

Micro-well arrays;Micro-scale technology;Polydimethylsiloxane

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）03－0121－08

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.001

100144 北京市 中國醫學科學院整形外科醫院乳房整形與再造中心。

欒杰（E-mail：doctorluan@hotmail.com）。

2011年5月8日；

2011年6月12日)