理化因素和牛至、留蘭香、竹葉提取物對羊肌紅蛋白穩定性的影響

李 素，臧明伍，趙 冰，張順亮，王守偉，朱 寧，潘曉倩，劉 夢，吳倩蓉，劉博文

（中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

生物化學或微生物因素引起的產品變質是肉品行業關注的焦點問題，由生物化學變化引起的肉類變質最常見的形式是脂質和含血紅素蛋白質的氧化。氧化反應會導致肉類產品風味、質地和顏色發生變化，而色澤是影響消費者接受度的最直觀指標。在充分放血的肌肉中，肌紅蛋白（myoglobin，Mb）是影響肉色的重要因素，因此，維持Mb的穩定性有助于提升肉類產品的色澤品質。Mb穩定性與溫度、pH值、氧分壓、鹽離子等有重要關系，脂肪氧化的中間產物也可以促進Mb的氧化。為抑制肉品發生氧化反應，通常在加工過程中使用抗氧化劑。近年來，消費者對綠色健康食品的需求日益增加，許多消費者對化學合成食品添加劑持有一定排斥態度，認為它們不健康或不安全，這一發展趨勢促使替代或減少傳統化學合成食品添加劑使用的技術成為研究熱點。植物提取物具有一定的抑菌和抗氧化能力，可抑制不良微生物的生長，減少脂肪氧化，延緩肉制品品質劣變。目前，植物提取物的應用方式主要為將其加入產品中、涂在產品表面，或加入到包裝材料中。羊肉是我國重要的畜產品，目前對冷鮮羊肉外觀色澤穩定性的研究較多，辛建增等研究3-磷酸甘油醛對羊肉色澤穩定性和高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）還原的影響，但仍缺少對羊肉中Mb穩定性機理研究的報道，尤其是植物提取物對Mb穩定性的研究。

氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OxyMb）可使動物肌肉保持鮮紅的色澤，但易發生氧化反應生成MetMb，從而影響肌肉色澤。為研究羊肉Mb變化引起的色澤劣變機理，本研究從羊肉中提取Mb，并制備OxyMb，通過氧化模型分析NaCl、pH值、溫度和牛至、留蘭香、竹葉提取物對OxyMb穩定性的影響，為實際羊肉產品生產加工時色澤劣變控制機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊后腿肉購于市場。

連二亞硫酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀 國藥集團化學試劑有限公司；留蘭香提取物、牛至提取物 建明工業（珠海）有限公司；竹葉提取物浙江圣世生物科技有限公司；NaCl（食品級） 美添前景科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA822-CW天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；05P-22離心機 日本日立公司；M2e多功能酶標儀 德國MD公司。

1.3 方法

1.3.1 Mb提取和OxyMb制備

參考孫沖等的方法提取Mb并制備OxyMb，對方法進行適當調整。取適量絞碎的瘦肉，加入3 倍體積預冷的緩沖液（10 mmol /L Tris-HCl，pH 8.5），于13 000 r/min下勻漿2 min，離心（4 ℃、10 000×、15 min）后取清液，置于飽和度65%的硫酸銨溶液中鹽析1 h；上清液再次離心（4 ℃、10 000×、15 min），取濾液，采用考馬斯亮藍法測定蛋白質量濃度。調整Mb溶液質量濃度為5 mg/mL，取5 mL Mb溶液與50 mg連二亞硫酸鈉反應得OxyMb。用10 倍體積預冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）透析20 次，除去多余的連二亞硫酸鈉。將透析后的OxyMb質量濃度調至0.2 mg/mL，以緩沖溶液作空白，根據Krzywicki的方法測定透析后的OxyMb溶液在572、565、545、525 nm波長處的吸光度，總Mb含量和OxyMb、MetMb相對含量分別按式（1）～（3）計算。

式中：、和分別為/、/和/。

1.3.2 NaCl質量濃度對OxyMb穩定性的影響

取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別加入0～6 g/100 mL的等差質量濃度（0.5 g/100 mL）梯度NaCl溶液，于室溫靜置15 min，取樣測定其525、545、565、572 nm波長處吸光度，分別根據式（2）、（3）計算OxyMb和MetMb相對含量，平行測定3 次，取平均值。

1.3.3 pH值對OxyMb穩定性的影響

取0.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于10 mL離心管中，加入pH值分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液7.5 mL，于4 ℃條件下孵育6 h，取樣測定其525、545、565、572 nm波長處吸光度，分別根據式（2）、（3）計算OxyMb和MetMb相對含量，平行測定3 次，取平均值。

1.3.4 溫度對OxyMb穩定性的影響

取3 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別于4 ℃冰箱和10～100 ℃的等差溫度（5 ℃）梯度水浴中靜置15 min，然后將樣品取出，迅速冰水浴冷卻，取樣測定525、545、565、572 nm波長處吸光度，分別根據式（2）、（3）計算OxyMb和MetMb相對含量，平行測定3 次，取平均值。

1.3.5 牛至、留蘭香、竹葉提取物對OxyMb穩定性的影響

取1.5 mL 0.2 mg/mL OxyMb溶液于5 mL離心管中，分別加入0.5 mL質量濃度為0、1、2、3、4、5 mg/100 mL的竹葉提取物、留蘭香提取物、牛至提取物作為抗氧化物，于4 ℃靜置0、2、4、6、8、10、12、14、16 d后取出測定吸光度，計算OxyMb和MetMb相對含量。

1.4 數據處理

利用Origin 8.0軟件進行繪圖，利用SPSS Statistics 21.0軟件進行平均值、標準差計算。

2 結果與分析

2.1 NaCl質量濃度對羊肉OxyMb穩定性的影響

由圖1可知，隨著NaCl質量濃度的增大，OxyMb相對含量呈先上升后下降的趨勢，在1.5 g/100 mL時達到最大，為67.07%，說明1.5 g/100 mL質量濃度的NaCl溶液中OxyMb的穩定性較好。而MetMb相對含量沒有明顯變化，說明MetMb受NaCl的影響不大。向丹在不同NaCl質量濃度對豬Mb穩定性影響研究中發現，MetMb含量也較為穩定，與本研究結果一致，但在3 g/100 mL的NaCl溶液中OxyMb含量最高。NaCl可以通過降低Mb對氧的親和性，促進OxyMb自動氧化為MetMb，研究結果的差異可能是由于Mb來源不同，對氧的親和度也不同，從而使得OxyMb在鹽溶液中的穩定性有差異。

圖1 NaCl質量濃度對羊肉OxyMb穩定性的影響Fig. 1 Effect of NaCl concentration on the stability of mutton OxyMb

2.2 pH值對羊肉OxyMb穩定性的影響

由圖2可知，隨著pH值從酸性至堿性變化，OxyMb相對含量呈逐漸上升趨勢，MetMb相對含量呈逐漸降低趨勢。在低pH值（4.2～5.0）時OxyMb相對含量上升緩慢，pH 5.0～7.0時，OxyMb相對含量明顯上升，pH 7.0～8.5時，OxyMb相對含量變化不明顯。MetMb在pH 4.5環境中生成量最高，但隨pH值升高其相對含量大幅降低，說明在酸性環境中穩定性較差，當pH值升至7.0時逐漸穩定，pH＞7.0時MetMb相對含量緩慢降低，說明其穩定性在堿性環境中高于酸性環境中。陳景宜等研究發現，低pH值會增加牛Mb自動氧化的速率，該變化規律與本研究趨勢一致，即低pH值環境不利于色澤的穩定，這可能是由于低pH值可降低Mb中血紅素與珠蛋白的結合能力，進而加速氧化。

圖2 pH值對羊肉OxyMb穩定性的影響Fig. 2 Effect of pH value on the stability of mutton OxyMb

2.3 溫度對羊肉OxyMb穩定性的影響

由圖3可知，隨著溫度的升高，OxyMb相對含量呈逐漸降低的趨勢。在4～30 ℃范圍內，OxyMb相對含量變化不明顯；當溫度高于35 ℃時，OxyMb相對含量明顯下降，表明OxyMb的結構發生很大變化，蛋白變性加劇；當溫度高于70 ℃時，OxyMb相對含量幾乎為零。而MetMb相對含量隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，在4～30 ℃范圍內，MetMb相對含量上升緩慢；當溫度高于35 ℃時，MetMb相對含量顯著增加（＜0.05），表明OxyMb氧化劇烈；當溫度高于70 ℃時，MetMb相對含量急劇下降，與OxyMb的變化一致，說明Mb完全變性。Sen等研究羊排中Mb穩定性發現，隨溫度升高（51、65、71、79 ℃）可溶性Mb相對含量降低，而Mb變性比率相應增加。在牛肉Mb的穩定性研究中也發現類似結果。但也有研究表明，Mb在肌肉中的熱穩定性比在與肌肉相同pH值和離子強度的溶液中的熱穩定性低得多，因此，在實際生產加工過程中需要從多方面綜合考慮，以提升Mb的穩定性。

圖3 溫度對羊肉OxyMb穩定性的影響Fig. 3 Effect of temperature on the stability of mutton OxyMb

2.4 牛至、留蘭香、竹葉提取物對羊肉OxyMb穩定性的影響

2.4.1 牛至提取物對OxyMb穩定性的影響

由圖4可知，隨著牛至提取物質量濃度的增加，OxyMb相對含量呈先升高后降低的趨勢，在2 mg/100 mL時達到最大。但1～3 mg/100 mL組的OxyMb相對含量與對照組無明顯差異，而4～5 mg/100mL組的OxyMb相對含量明顯低于對照組。在貯藏15 d時，各組的OxyMb相對含量為6.7%～11.6%，MetMb相對含量的變化規律與OxyMb的變化負相關，說明牛至提取物對OxyMb穩定性的保護作用不穩定，不適宜的添加量甚至會促進羊肉OxyMb的氧化。有研究表明，香芹酚、對傘花烴、-松油烯和百里香酚是牛至提取物中發揮抗氧化作用的主要化合物，可通過向自由基提供電子，或阻斷氧化過程中的自由基鏈式反應等途徑起到延緩肉制品中脂肪氧化的作用。本研究結果發現，牛至提取物在單一模擬體系下對維持羊肉OxyMb穩定性方面無明顯效果。

圖4 牛至提取物對羊肉OxyMb穩定性的影響Fig. 4 Effect of oregano extract on the stability of mutton OxyMb

2.4.2 留蘭香提取物對OxyMb穩定性的影響

留蘭香提取物中含有一定含量的酚類和黃酮類物質，使其具有抗菌和抗氧化作用。由圖5可知，隨著留蘭香提取物質量濃度的增加，OxyMb相對含量呈先升高后降低的趨勢，在4 mg/100 mL時達到最大，且添加留蘭香提取物的樣品中OxyMb相對含量均高于對照組。在前6 d的貯藏過程中，不同組之間OxyMb和MetMb相對含量的差異不明顯，貯藏后期，4 mg/100 mL組的樣品中OxyMb相對含量明顯高于其他組，在貯藏15 d時仍保持在23.8%左右。MetMb相對含量的變化規律與OxyMb的變化負相關，充分說明留蘭香提取物對羊肉OxyMb穩定性的保護作用較好。留蘭香提取物在肉制品中的應用機理研究較少，本研究發現，留蘭香提取物可提升羊肉OxyMb在模擬體系中的穩定性。

圖5 留蘭香提取物對羊肉OxyMb穩定性的影響Fig. 5 Effect of magnolia extract on the stability of mutton OxyMb

2.4.3 竹葉提取物對OxyMb穩定性的影響

竹葉提取物是從竹葉中提取的天然食品抗氧化劑，在食品中應用較為廣泛，大量研究表明，竹葉提取物具有較好的抗氧化和抑菌作用，其有效成分主要為黃酮類、內酯類和酚酸類化合物。由圖6可知，隨著竹葉提取物質量濃度的增加，OxyMb相對含量呈逐漸增大的趨勢，在5 mg/100 mL時達到最大，且在整個貯藏過程中，1～5 mg/100 mL組的OxyMb相對含量均明顯高于對照組。在貯藏8 d時，1 mg/100 mL組OxyMb相對含量明顯降低，與對照組無明顯差異，貯藏至15 d時，2～5 mg/100 mL組的OxyMb相對含量為19.3%～22.5%，均高于1 mg/100 mL組和對照組貯藏13 d時的OxyMb相對含量。MetMb相對含量的變化規律與OxyMb的變化負相關，在貯藏終點，對照組MetMb相對含量最高。說明在該模擬體系中，竹葉提取物對羊肉OxyMb穩定性具有較好的提升作用。

圖6 竹葉提取物對羊肉OxyMb穩定性的影響Fig. 6 Effect of bamboo leaf extract on the stability of mutton OxyMb

選用的植物提取物均含有抑菌、抗氧化活性物質，對肉類的脂肪和蛋白質具有一定的抗氧化作用，不同活性物質對脂肪或蛋白質氧化抑制作用機理不同。目前，比較認可的植物活性物質抗氧化作用機理主要有直接清除自由基、螯合金屬離子，或本身被氧化成自由基中間體，抑制自由基對脂肪或蛋白質的氧化等。本研究OxyMb氧化模擬體系中，不同植物提取物對OxyMb抗氧化效果不同，可能是由于抗氧化活性物質所含有的如酚羥基等極性基團與模擬體系中的氧氣相結合，減少了OxyMb與氧氣的接觸量，從而延緩了蛋白的氧化速率，提升了OxyMb穩定性。不同植物提取物對OxyMb穩定性影響差異性可能與所含有效活性物質種類不同有關。

3 結 論

通過采用羊肉Mb制備OxyMb，并對其理化穩定性條件進行分析，結果表明：1.5 g/100 mL的NaCl溶液可以提高OxyMb穩定性，而不同質量濃度NaCl溶液對MetMb相對含量影響較?。籶H值對OxyMb穩定性具有明顯影響，堿性環境下OxyMb穩定性較好，酸性環境不利于OxyMb的穩定性；高溫可促使OxyMb發生氧化變性反應，當加熱溫度低于30 ℃時Mb穩定性較好，隨加熱溫度繼續升高，OxyMb相對含量明顯降低，MetMb開始大量形成。選用牛至提取物、留蘭香提取物和竹葉提取物，分析其對OxyMb穩定性，研究發現，隨著貯藏時間的延長，OxyMb相對含量呈逐漸降低趨勢，MetMb相對含量呈逐漸增大的趨勢，說明Mb在貯藏過程中不斷地發生氧化反應。所選用的3 種植物提取物對羊肉OxyMb穩定性具有一定保護作用，其中，留蘭香提取物和竹葉提取物對OxyMb穩定性保護效果較好，而牛至提取物對OxyMb穩定性無明顯提升作用，不適宜的添加量甚至會促進OxyMb的氧化。肉及肉制品組成基質較為復雜，由羊肉Mb引起的色澤品質變化也受多方面因素影響，因此，在后續工作中對各理化因素和植物提取物對羊肉色澤品質影響機理研究將引入更多模擬條件。