帕瑞昔布鈉對宮頸癌細胞COX2/PGE2通路及細胞生物學行為的影響

張丹琦 趙濱濱 牛漢斌 劉丕弘

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發病率、死亡率較高，在世界范圍內，發病率、死亡率分別位居女性腫瘤的第五位、第四位，且新發病例有逐漸年輕化的趨勢，對女性健康危害極大[1]。目前宮頸癌的治療主要以手術治療、放射治療、化學治療、綜合治療等為主，在手術、放療前給予適當化學治療，可能提升手術效果，提高放療敏感性，改善患者預后[2]。因此，繼續深入研究宮頸癌的發展機制并探索治療新手段仍有很大意義。環氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)是前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)合成的關鍵酶，在腫瘤病理狀態下可被誘導表達[3]。有研究發現，COX2/PGE2通路參與多種癌癥的生物學過程，下調COX2、PGE2表達可以抑制大腸癌細胞增殖、侵襲能力并誘導細胞凋亡[4-6]。在宮頸癌中的研究亦表明，柚皮苷抑制宮頸癌細胞生長的機制可能與抑制COX2蛋白表達有關[7]。帕瑞昔布鈉是一種高選擇性COX2抑制劑，在手術術中、術后的療效已被廣泛證實，常用于腫瘤切除的手術中[8]。本研究探討帕瑞昔布鈉對宮頸癌細胞COX2/PGE2通路及增殖、凋亡、侵襲等細胞學行為的影響，以期為宮頸癌患者的臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人宮頸癌HeLa細胞(貨號：ZY-H066)購自美國ATCC細胞庫；胎牛血清(貨號：FBS500-S)購自澳大利亞AusGeneX公司；RPMI-1640培養液(貨號：GMS12052.4.1)購自美國GENMED公司；帕瑞昔布鈉(貨號：CY20340)購自北京凱瑞基生物科技有限公司；MTT溶液(貨號：N/A-896)購自美國AMEKO公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：S0185)購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；Matrigel基質膠(貨號：356234)購自美國BD公司；結晶紫(貨號：0528-100G)購自美國Amresco公司；qRT-PCR試劑盒(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；COX2、PGE2、GAPDH引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；TRIzol、逆轉錄試劑盒(貨號：15596018、AB-4366596)購自美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒(貨號：ZYC3001)購自上海澤葉生物科技有限公司；COX2抗體、PGE2抗體、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體、基質金屬蛋白酶-9(matrix met alloproteinase-9，MMP-9)抗體、GAPDH抗體(貨號：ab23672、ab2318、ab53154、ab73734、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司。培養箱(型號：MIR-162-PC/MIR-262-PC)購自日本松下公司；酶標儀(型號：Stat Fax-2100)購自美國Awareness公司；流式細胞儀(型號：BD FACSCanto II)購自美國BD公司；顯微鏡(型號：CX31)購自日本Olympus公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；化學發光成像系統(型號：MG8000)購自美國Thmorgan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:將HeLa細胞培養在37℃、5% CO2培養箱中，培養基為含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基，根據細胞的生長狀態，每2～3天傳代1次，取生長良好、穩定的對數生長期細胞用于以下實驗。將HeLa細胞密度調整為1×105個/ml，按每孔100 μl接種于96孔培養板，分為對照組、低濃度帕瑞昔布鈉組、中濃度帕瑞昔布鈉組和高濃度帕瑞昔布鈉組。對照組不加入任何藥物，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組分別加入終濃度為10 μmol/L、40 μmol/L、160 μmol/L的帕瑞昔布鈉。

1.2.2 MTT法檢測HeLa細胞增殖情況:將4組HeLa細胞培養48 h，加入MTT試劑，培養4 h，吸除上清液，加DMSO，震蕩至結晶溶解，在酶標儀上檢測490 nm波長處的吸光度(optical density，OD)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率(%)=(OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測HeLa細胞凋亡情況:將4組HeLa細胞培養48 h，離心收集細胞，消化、洗滌，將細胞調整為1×106個/ml的細胞懸浮液，按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書進行操作，加入Annexin V-FITC、PI染色，避光孵育1 h，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.2.4 Transwell法檢測HeLa細胞侵襲情況:用無血清培養基稀釋Matrigel基質膠，預鋪在Transwell小室中，室溫凝固。Transwell小室上層加入200 μl無血清培養液制成2.5×105個/ml的細胞懸浮液，下室中加500 μl含10%胎牛血清的培養液，常規孵育24 h，用棉簽擦去小室上層細胞，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%結晶紫染液染色20 min，洗滌。在倒置顯微鏡(200×)下隨機選取6個視野觀察，拍照并統計侵襲細胞數。

1.2.5 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法檢測HeLa細胞中COX2、PGE2 mRNA表達情況:將4組HeLa細胞培養48 h，離心收集細胞，用TRIzol法提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書步驟逆轉錄合成cDNA，以GAPDH為內參基因，按照qRT-PCR試劑盒說明書步驟檢測COX2、PGE2 mRNA表達水平，以2-ΔΔCt法表示，△△Ct=實驗組(Ct目的基因-CtGAPDH)-對照組(Ct目的基因-CtGAPDH)。反應程序：95℃×15 min；95℃×10 s，63℃×20 s，72℃×30 s，共循環40次。COX2上游引物：5’-TGAAACCCACTCCAAACACA-3’，下游引物：5’-GAGAAGGCTTCCCAGCTTTT-3’；PGE2上游引物：5’-AAGCAGCGTTGGGAGCA-3’，下游引物：5’-GCTG

GCGATGAACAACGAG-3’；內參GAPDH上游引物：5’-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3’，下游引物：5’-ATGC

AGGGATGATGTTCTGG-3’。

1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測HeLa細胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達情況:將4組HeLa細胞培養48 h，離心收集細胞，加入裂解液靜置、離心提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離、轉移至PVDF膜上、5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(COX2抗體、PGE2抗體、Bax抗體、MMP-9抗體、GAPDH抗體)，4℃下孵育過夜，TBST洗滌，加羊抗兔二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌，ECL法顯色、顯影處理，凝膠成像系統掃描圖像，分析條帶灰度值。

2 結果

2.1 4組HeLa細胞增殖情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細胞增殖率顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細胞增殖率依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組HeLa細胞增殖率比較

2.2 4組HeLa細胞凋亡情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細胞凋亡率依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表2。

表2 4組HeLa細胞凋亡率比較

2.3 4組HeLa細胞侵襲情況 與對照組比較，低濃度帕瑞昔布組、中濃度帕瑞昔布組、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細胞侵襲細胞數顯著減少，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細胞侵襲細胞數依次減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表3。

表3 4組HeLa細胞侵襲細胞數比較 個,

對照組 低濃度帕瑞昔布鈉組 中濃度帕瑞昔布鈉組 高濃度帕瑞昔布鈉組

2.4 4組HeLa細胞中COX2、PGE2 mRNA表達情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細胞中COX2、PGE2 mRNA表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細胞中COX2、PGE2 mRNA表達水平依降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組HeLa細胞中COX2、PGE2 mRNA表達水平比較

2.5 4組HeLa細胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達情況 與對照組比較，低、中、高濃度帕瑞昔布鈉組HeLa細胞中COX2、PGE2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Bax蛋白表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著帕瑞昔布鈉濃度的升高，HeLa細胞中COX2、PGE2、MMP-9蛋白表達水平依次降低，差異有統計學意義(P<0.05)，Bax蛋白表達水平依次升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表5。

圖3 4組HeLa細胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達情況

表5 4組HeLa細胞中COX2、PGE2、Bax、MMP-9蛋白表達水平比較

3 討論

宮頸癌是女性高發惡性腫瘤。據臨床流行病學大數據顯示，全球范圍內，宮頸癌每年新發病例約有50萬，約占所有腫瘤新發病例的5%，其中，發生在發展中國家的新發病例占80%以上，每年死亡例數超過26萬，主要集中在低、中收入國家[9]。而中國宮頸癌每年新發病例約有13.15萬，死亡例數約有5.3萬，約占所有女性惡性腫瘤死亡例數的18.4%，嚴重危害我國女性健康與生命[10]。而現有治療方式對早期宮頸癌的療效較好，對中晚期宮頸癌的療效欠佳，總體5年生存率仍然偏低，探索更有效的宮頸癌治療方法仍是研究人員亟需解決的問題[11]。

手術切除是宮頸癌治療中最直接有效的治療方式，但術后疼痛是腫瘤復發、轉移的潛在影響[12]。帕瑞昔布鈉是一種新型選擇性非甾體類抗炎藥，具有鎮痛、抗炎、解熱功效，且與臨床鎮痛常用阿片類藥物相比，不良反應較少，已廣泛用于腫瘤手術治療中[13]。本研究結果顯示，低、中、高濃度的帕瑞昔布鈉處理HeLa細胞均可降低細胞增殖率及侵襲細胞數，提高細胞凋亡率，且帕瑞昔布鈉處理濃度越高，對HeLa細胞增殖、凋亡、侵襲生物學行為的影響越明顯，說明帕瑞昔布鈉可抑制HeLa細胞增殖、侵襲過程，并誘導HeLa細胞凋亡，在抗腫瘤治療中可能具有良好療效。Bax、MMP-9分別為常見的凋亡、侵襲相關蛋白，在各種類型腫瘤的凋亡、侵襲過程中均發揮重要作用[14]。本研究結果顯示，低、中、高濃度的帕瑞昔布鈉處理HeLa細胞均可提高HeLa細胞中Bax蛋白表達水平，降低MMP-9蛋白表達水平，且對Bax、MMP-9蛋白表達水平的影響隨著帕瑞昔布鈉處理濃度的升高而加劇，提示帕瑞昔布鈉可通過影響HeLa細胞中Bax、MMP-9表達，進而影響HeLa細胞的增殖、凋亡、侵襲行為，但具體機制還需進一步探討。

腫瘤的發生發展是一個復雜的過程，涉及多種癌變基因、多種信號通路協同發揮作用。COX2是PGE2合成的關鍵限速酶，在正常組織中幾乎不表達，在受到炎性介質、細胞因子、促癌劑等刺激后迅速表達上調[15]。有研究發現，COX2在多種腫瘤中高表達，與腫瘤的發生、轉移均存在密切聯系，在腫瘤細胞的侵襲、遷移過程中也發揮重要作用[16,17]。劉敏等[18]研究發現，miR-26a可能通過下調COX2表達，抑制宮頸癌Siha細胞的增殖和侵襲過程。陳杰等[19]研究表明，siRNA靶向沉默COX2基因，能夠促進HeLa細胞凋亡，抑制HeLa細胞增殖、遷移及侵襲能力。Ye等[20]研究表明，COX2、PGE2在宮頸瘤組織中過度表達，與宮頸癌的發展和進展高度相關。研究發現，帕瑞昔布鈉還是一種COX2抑制劑，能通過抑制COX2表達，減少花生四烯酸轉化為PGE2。本研究結果顯示，低、中、高濃度的帕瑞昔布鈉處理HeLa細胞均可降低細胞中COX2、PGE2 mRNA和蛋白表達水平，且帕瑞昔布鈉處理濃度越高，對細胞中COX2、PGE2表達的影響越明顯，提示帕瑞昔布鈉可能通過抑制COX2、PGE2表達，影響Bax、MMP-9表達，進而對HeLa細胞生物學行為產生一定影響。

綜上所述，帕瑞昔布鈉作為COX2抑制劑，可能通過抑制COX2、PGE2表達，影響Bax、MMP-9表達水平，抑制HeLa細胞的增殖、侵襲過程，并誘導HeLa細胞凋亡，有望成為治療宮頸癌的新型藥物。