甲基蓮心堿通過(guò)miR-3619-5p調(diào)控結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的THP-1凋亡及炎性反應(yīng)的分子機(jī)制

謝玉瑾 宋雪云 馬永春

結(jié)核的重要病原菌是結(jié)核分枝桿菌(MTB)，屬于典型胞內(nèi)菌感染，MTB侵入機(jī)體后可發(fā)展為活動(dòng)性肺結(jié)核，機(jī)體通過(guò)分泌前炎因子而清除病原菌感染，但前炎因子可進(jìn)一步加重機(jī)體損傷，因而減少炎性因子的釋放，可有效改善持續(xù)性病原菌感染[1]。研究表明藥物可發(fā)揮抗炎作用從而減輕MTB誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)[2,3]。甲基蓮心堿屬于雙芐基異喹啉生物堿，具有抗氧化、抗炎等作用，并可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜電位從而調(diào)控細(xì)胞凋亡，還可抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡[4]。但筆者查閱文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)關(guān)于甲基蓮心堿對(duì)MTB誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞(THP-1)凋亡及炎性反應(yīng)的影響尚未可知。微小RNA(miRNA)在MTB誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞中表達(dá)異常，并可調(diào)控細(xì)胞凋亡[5]。但miRNA在甲基蓮心堿調(diào)控MTB誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)過(guò)程中的作用機(jī)制尚未闡明。BCG誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中miR-3619-5p的表達(dá)水平降低，并可能參與病原菌感染過(guò)程[6]。但甲基蓮心堿是否可通過(guò)調(diào)控miR-3619-5p的表達(dá)從而抑制病原菌感染尚未可知。因此，本研究采用MTB誘導(dǎo)THP-1源巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討甲基蓮心堿對(duì)MTB誘導(dǎo)THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)的影響，探究其對(duì)miR-3619-5p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人單核細(xì)胞THP-1購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；甲基蓮心堿購(gòu)自購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司；佛波酯(PMA)、細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌(MTB)、MTB培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；miR-con、miR-3619-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-3619-5p購(gòu)自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組:THP-1細(xì)胞(1×106個(gè)/ml)接種于6孔板(200 μl/孔)，加入PMA(20 ng/ml)刺激48 h后細(xì)胞轉(zhuǎn)化為巨噬細(xì)胞[7]，將THP-1源巨噬細(xì)胞(1×105個(gè)/ml)接種于24孔板(100 μl/孔)，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后按照感染復(fù)數(shù)(MTB∶細(xì)胞=10∶1)感染巨噬細(xì)胞8 h[8]，PBS洗滌后加入含有慶大霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，記為MTB組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的THP-1源巨噬細(xì)胞作為NC組。分別加入不同濃度(1.25 μg/ml、2.5 μg/ml、5.0 μg/ml)的甲基蓮心堿培養(yǎng)基培養(yǎng)MTB感染的巨噬細(xì)胞24 h[9]，分別記為1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組。參照Lipofectamine2000試劑分別將miR-con、miR-3619-5p mimics轉(zhuǎn)染至MTB感染的巨噬細(xì)胞，分別記為MTB+miR-con組、MTB+miR-3619-5p組。參照Lipofectamine2000試劑分別將miR-con、miR-3619-5p mimics轉(zhuǎn)染至MTB感染的巨噬細(xì)胞，加入5.0 μg/ml 甲基蓮心堿培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別記為anti-miR-NC+Nef+MTB組、anti-miR-3619-5p+Nef+MTB組。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:取各組THP-1源巨噬細(xì)胞加入預(yù)冷PBS洗滌后棄上清，加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl Annexin V-FITC后充分混勻，于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育10 min，加入5 μl PI后室溫避光孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-10的水平:取各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA檢測(cè)TNF-α、IL-6、IL-10的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-3619-5p的表達(dá)水平:采用Trizol法提取各組THP-1源巨噬細(xì)胞中總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度與純度，RNA OD260/OD280處于1.8～2.0水平。反轉(zhuǎn)錄體系：RNA 2 μl，10×RT Buffer 2 μl，dNTP 0.4 μl，Multiscripe RT 1 μl，10×Random Primer 2 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：25℃ 10 min，37℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10 μl/孔，正反向引物0.8 μl/孔，cDNA 1 μl/孔，ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次。應(yīng)用美國(guó)ABI Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)細(xì)胞中miR-3619-5p的表達(dá)水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá):取各組THP-1源巨噬細(xì)胞加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用SDS-PAGE(10%)凝膠電泳分離蛋白，將其移至PDVF膜，脫脂牛奶(5%)封閉，分別添加Bax、Bcl-2與β-actin一抗(1∶1 000)，4℃孵育24 h，次日加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯影，Bax、Bcl-2均以β-actin為內(nèi)參基因，并采用Quantityone軟件檢測(cè)條帶灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度甲基蓮心堿對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白的影響 與NC組比較，MTB組凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)；與MTB組比較，1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 不同濃度甲基蓮心堿對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白的影響

圖1 不同濃度甲基蓮心堿對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡率及凋亡蛋白的影響;A 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;B Western Blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.2 Nef對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響 與NC組比較，MTB組TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)；與MTB組比較，1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組TNF-α、IL-6、IL-10的水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 Nef對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響

2.3 Nef對(duì)miR-3619-5p表達(dá)的影響 與NC組比較，MTB組miR-3619-5p的表達(dá)水平降低(P<0.05)；與MTB組比較，1.25 μg/ml Nef+MTB組、2.5 μg/ml Nef+MTB組、5.0 μg/ml Nef+MTB組miR-3619-5p的表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 Nef對(duì)miR-3619-5p表達(dá)的影響

2.4 高表達(dá)miR-3619-5p對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響 與MTB+miR-con組比較，MTB+miR-3619-5p組凋亡率降低(P<0.05)，Bax蛋白水平降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表4，圖2。

圖2 Western Blot檢測(cè)Bax、Bcl-2表達(dá)

表4 高表達(dá)miR-3619-5p對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響

2.5 低表達(dá)miR-3619-5p可以逆轉(zhuǎn)Nef對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響 與anti-miR-NC+MTB組比較，anti-miR-3619-5p+MTB組凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)；與anti-miR-NC+Nef+MTB組比較，anti-miR-3619-5p+Nef+MTB組凋亡率升高(P<0.05)，Bax蛋白水平升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)，TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表5。

圖3 Western Blot檢測(cè)Bax、Bcl-2表達(dá)

表5 低表達(dá)miR-3619-5p可以逆轉(zhuǎn)Nef對(duì)MTB處理的巨噬細(xì)胞凋亡和細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響

3 討論

甲基蓮心堿能夠減輕LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放和NOS的活力有關(guān)[10]。甲基蓮心堿通過(guò)miR-29a-3p/AQP4抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷，促進(jìn)細(xì)胞存活，并抑制細(xì)胞凋亡[11]。甲基蓮心堿能減輕腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制與抑制細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡率升高，并可促進(jìn)Bax表達(dá)及抑制Bcl-2表達(dá)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]相似。提示成功構(gòu)建模型。本研究結(jié)果顯示，甲基蓮心堿可明顯降低MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡率，并可抑制Bax表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，提示甲基蓮心堿可抑制MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡。

IL-6、TNF-α、IL-10可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，其在機(jī)體中表達(dá)水平降低可調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能及抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]。本研究結(jié)果顯示，MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-10的水平升高，而甲基蓮心堿處理后可明顯降低TNF-α、IL-6、IL-10的水平，提示甲基蓮心堿可抑制炎性反應(yīng)從而減輕MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞損傷。

本研究顯示，MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞中miR-3619-5p的表達(dá)水平降低，而甲基蓮心堿可提高miR-3619-5p的表達(dá)水平，提示甲基蓮心堿可能通過(guò)上調(diào)miR-3619-5p的表達(dá)發(fā)揮作用。研究表明miR-3619-5p在人胎道平滑肌細(xì)胞中呈低表達(dá)，可調(diào)控細(xì)胞增殖過(guò)程[15]。miR-3619-5p可抑制膀胱癌的進(jìn)展[16]。circZFR通過(guò)調(diào)節(jié)miR-3619-5p/CTNNB1軸而促進(jìn)肝癌的進(jìn)展[17]。本研究顯示，miR-3619-5p過(guò)表達(dá)可明顯降低MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6、IL-10的水平，而抑制miR-3619-5p表達(dá)可提高M(jìn)TB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡及TNF-α、IL-6、IL-10的水平，提示miR-3619-5p過(guò)表達(dá)可抑制MTB誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)。本研究顯示，抑制miR-3619-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)甲基蓮心堿對(duì)MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)的作用。

綜上所述，甲基蓮心堿可通過(guò)上調(diào)miR-3619-5p的表達(dá)而抑制MTB誘導(dǎo)的THP-1源巨噬細(xì)胞凋亡及炎性反應(yīng)從而緩解結(jié)核感染，甲基蓮心堿可能具有緩解MTB誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)作用，并可能成為調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的抗結(jié)核治療的新藥物。