血清和組織PLAC1在結腸癌診斷和判斷淋巴結轉移風險中的臨床價值

閆龍超，楊琳，楊明，潘吉勇

(大連市第三人民醫院 普通外科一病房，遼寧 大連 116000)

結直腸癌是全球發病和死亡率均高居前5位的消化道惡性腫瘤之一[1]，因為缺乏早期癥狀，超過一半的患者在診斷時已發生淋巴結或遠處轉移[2]。因此尋求腸癌診斷和判斷淋巴結轉移風險的生物標志物具有重要的臨床價值。織胎盤特異性基因1(placenta-specific 1，PLAC1)是近年來發現的胎盤抗原之一，其正常組織表達有限，在胎盤功能和發育中起著重要作用[3]。據報道，PLAC1在多種癌癥中被過度激活，例如在一項乳腺癌研究中97% 的腫瘤活檢中都檢測到PLAC1陽性表達[4]。鑒于PLAC1組織特異性以及其可能的促癌因子活性，本研究旨在通過前瞻性研究探討結腸癌組織中PLAC1的表達變化，并進一步明確其在疾病診斷和判斷淋巴結轉移風險中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1 生物信息學分析

從TCGA數據庫中下載結腸癌RNA-seq表達數據和相應的患者臨床資料，包括421個腫瘤組織標本和41個正常結腸組織標本。以每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的轉錄本(transcripts per kilobase of exon model per million mapped reads，TPM)數據衡量基因表達量。基于PLAC1不同表達，對其中421例患者完成生存隨訪分析。

1.2 一般資料

對2018年3月至2021年3月在我院完成結腸癌根治術的151例病理診斷為結腸癌的患者(結腸癌組)制作了腫瘤組織和癌旁正常組織(距腫瘤切緣>5 cm，且術后經病理證實無癌細胞侵犯)的病理組織學切片，其中男88例，女63例;年齡23～81歲，平均(62.52±14.70歲)。收集患者的相關臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤部位、直徑、浸潤深度、分化程度、淋巴結轉移、肝轉移等。納入標準：(1)所有患者的腫瘤組織標本均經病理學檢查(由1名經過認證的外科醫生和病理學專家共同確定)確診為原發性結腸癌；(2)所有患者術前均未接受放療、化療、靶向治療等抗腫瘤治療；(3)手術切緣陰性(R1)。排除合并其他惡性腫瘤、多發性結腸息肉、自身免疫性疾病、嚴重心臟疾病(心力衰竭、急性心肌梗死等)、嚴重內科疾病(血液系統疾病、急慢性感染、慢性阻塞性肺病、肝功能不全、腎衰竭等)者。另外納入150例非癌患者的血清樣本作為正常組，其中男80例，女70例；年齡18～87歲，平均(61.49±15.20歲)。2組年齡、性別構成比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究屬于臨床實驗性研究，獲得了醫院倫理委員會批準以及患者和家屬的知情同意。

1.3 免疫組化法檢測組織PLAC1的表達

取手術切除的新鮮組織標本置于 4% 的甲醛溶液中固定，石蠟包埋后連續切片成厚度為 3～4 μm樣本，樣本依次經二甲苯脫蠟(2 次，每次 10 min)、梯度酒精水化、檸檬酸緩沖液修復(10 mmol·L-1，pH 6.0，20 min)，之后滴加3%過氧化氫，放入微波爐中孵育 10 min滅活內源性過氧化物酶。用10%山羊血清封閉30 min后滴加PLAC1一抗(Abcam 公司，美國)并于4 ℃孵育過夜，PBS漂洗后加辣根酶標記羊抗兔 IgG室溫孵育10 min，PBS 漂洗后經 DAB 顯色和蘇木精復染，晾干后用中性樹膠固定。由兩名訓練有素的研究人員在不知道患者臨床信息的情況下，對每個病理玻片隨機選取5個高倍鏡視野(約1 000個細胞)進行了審查。結果判斷：PLAC1 蛋白陽性著色主要分布于細胞質，呈棕褐色或棕黃色。判斷標準[5]為：基本不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計算每個載玻片核心區域PLAC1+細胞數，著色細胞占細胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。最后得分為每張切片相同區域的腫瘤細胞著色程度得分與著色細胞百分率的得分相乘，最終得分≤3分為無表達(陰性)，≥4分為陽性表達。

1.4 酶聯免疫吸附試驗檢測血清PLAC1水平

在手術前采集患者的血清樣本，采用酶聯免疫吸附試劑盒(MyBioSource公司，美國，貨號：#MBS931690)檢測血清PLAC1蛋白水平。血清用生理鹽水稀釋1∶10，使用重組人PLAC1標準品擬定標準曲線，將血清樣本的450 nm處的吸光度值與標準曲線比較計算血清PLAC1蛋白濃度。陽性反應定義為吸光度值超過相對稀釋的陰性對照組的平均吸光度值1個標準差。

1.5 統計學處理

使用SPSS 20.0軟件包對數據進行統計學分析。血清PLAC1水平不符合正態分布，以中位值(四分位距)表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例(率)表示，比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線，計算曲線下面積(area under ROC curve，AUC)。

2 結 果

2.1 生物信息學分析結果

于2021年3月從TCGA數據庫下載RNA-Seq表達數據和患者臨床特征資料。患者男227例，女194例；年齡31～89歲；臨床分期Ⅰ期17.34%(n=73)、Ⅱ期38.48%(n=162)、Ⅲ期30.64%(n=129)、Ⅳ期13.54%(n=57)；13.54%(n=57)的患者發生遠處轉移，40.62%(n=171)的患者發生淋巴結轉移。我們從TCGA數據庫共下載了421個腫瘤組織樣本和41個正常結腸組織樣本，采用 Wilcoxon signed Rank Test法比較，腫瘤組織中PLAC1的表達量明顯高于正常組織(P<0.01)，且高表達的PLAC1與遠處轉移(M1vs.M0，P<0.001)、淋巴結轉移(N1+vs.N0，P<0.001)、臨床分期(Ⅳ期vs.Ⅰ期，P<0.001)有相關性。另外，根據Survminer 軟件包得到的0.89臨界值，將結腸癌患者依據危險評分分為高危組和低危組。繪制Kaplan-Meier生存曲線，高表達PLAC1患者無病生存率和總生存率相對不良(P<0.05)。見圖1。

2.2 結腸癌組織和癌旁正常組織PLAC1蛋白表達情況

結腸癌組織和癌旁正常組織中PLAC1蛋白陽性表達率分別為64.90%(98/151)和18.54%(28/151)，與癌旁正常組織相比，腫瘤組織中PLAC1蛋白陽性表達率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

2.3 結腸癌組和正常組血清PLAC1水平比較

正常組和結腸癌組血清PLAC1水平分別為42.51(22.90，62.85)ng·ml-1、86.70(45.50，210.00)ng·ml-1，結腸癌組患者血清PLAC1水平明顯高于正常組(Z=-11.071，P<0.05)。對于結腸癌患者，組織PLAC1蛋白陽性者血清PLAC1水平高于組織PLAC1蛋白陰性表達者[151.25(87.00，260.50)ng·ml-1vs.39.90(25.50，61.60)ng·ml-1，Z=-9.760，P<0.05]。此外組織PLAC1蛋白陽性者血清PLAC1水平高于正常組(Z=-34.018，P<0.05)，但是組織PLAC1蛋白陰性者血清PLAC1水平與正常組比較差異無統計學意義(Z=-1.003，P=0.378)。

2.4 結腸癌組織和血清PLAC1表達與淋巴結轉移的關系

以血清PLAC1水平中位值(86.70 ng·ml-1)為界限，≤86.70 ng·ml-1為低表達，否則為高表達。組織PLAC1高表達與腫瘤直徑>5 cm、淋巴結轉移及TNM Ⅲ～Ⅳ分期有關(P<0.05)；血清PLAC1水平亦與淋巴結轉移及TNM Ⅲ～Ⅳ分期有關(P<0.05)。見表1。

表1 結腸癌患者組織和血清PLAC1表達水平與臨床病理特征的關系

2.5 ROC曲線分析血清PLAC1水平用于結腸癌診斷和預測淋巴結轉移的臨床價值

經ROC曲線分析，血清PLAC1水平診斷結腸癌的AUC為0.962(95%CI：0.934～0.989)，靈敏度和特異度分別為94.6%和92.2%。血清PLAC1水平預測結腸癌淋巴結轉移的AUC為0.868(95%CI：0.828～0.908)，靈敏度和特異度分別為81.5%和76.2%。見圖3。

A.PLAC1不同組織、不同M分期、不同N分期、不同TNM分期中的表達差異；B.腫瘤組織中PLAC1表達情況與無病生存率和總生存率之間的關系圖1 基于TCGA數據庫信息分析PLAC1在正常組織和結腸癌組織中的表達差異

3 討 論

結腸癌的發生和發展涉及到多種遺傳因素的變化，因此患者的預后差異很大，除了是否涉及癌基因突變外，還取決于腫瘤TNM分期、病理類型、分化程度等因素。多年來，許多學者一直在不斷尋找與結腸癌的診斷和預后相關的標志物。近年來越來越多的分子靶點逐漸被納入臨床應用，如EGFR/K-RAS/BRAF[6]、PD-1/PD-L1[7]等。然而，長期效應仍缺乏大樣本、多中心臨床數據的支持。因此，迫切需要具有廣泛意義的指標來指導臨床診斷和治療。本研究中我們發現，PLAC1在結腸癌組織中呈高表達，而且與淋巴結轉移和TNM分期有關，這與TCGA數據庫中得到的生物學信息相一致。

在過去的20年里，免疫療法在癌癥治療方面取得了前所未有的進展，使醫學腫瘤學發生了革命性的變化。然而，癌癥免疫治療的一個主要障礙是識別適當的腫瘤特異性抗原，使靶向治療能夠更小地影響正常細胞[8]。胚胎植入時滋養層細胞植入子宮內膜，與腫瘤生長、遷移和侵襲極為相似。胎盤和腫瘤的發展及生長之間的相似之處，激發了許多研究者去發現癌癥的有效免疫治療抗原[9]。PLAC1是一個xq26鏈接基因，全長92 641 bp，含3個外顯子，第3外顯子為編碼區，轉錄單位全長1 126 bp，共編碼212個氨基酸。PLAC1編碼微絨毛膜蛋白，在胎盤滋養層細胞表面高表達，在睪丸中低表達，但在正常的體細胞組織中不表達，與其他癌癥/睪丸抗原相比，在正常組織中表達最為受限[10]。在腫瘤的發生發展過程中，許多在胚胎中正常表達的基因在癌細胞中被重新激活，PLAC1是一類新的在胚胎組織和腫瘤組織中高表達的腫瘤相關抗原。Silva等[11]首次報道了PLAC1 mRNA在包括乳腺癌、結腸癌、肺癌在內的17種不同惡性腫瘤的人類癌細胞系中呈高表達，因此對于乳腺癌和其他腫瘤，PLAC1已經成為基于抗體治療的合適靶點之一。據報道，PLAC1具有較強的免疫原性，有望成為一些癌癥患者區分于健康人群表達特征的潛在靶標[12]。本研究使用免疫組化和ELISA檢測證實，PLAC1蛋白在結腸癌組織和患者血清中均呈高表達，并與疾病進展有關。這意味著PLAC1有望成為癌癥免疫治療的潛在靶點。

先前的研究發現，人類乳腺癌細胞中的PLAC1轉錄受到許多與PPARd和其他核受體相關的輔助激活因子的調節，包括 C/EBPβ和NCOA3，這兩種輔助激活因子都與乳腺癌的進展有關[3]。此外Li等[13]研究也證實，PLAC1和Furin相互作用進而降解Notch1信號蛋白，產生Notch1胞內結構域(Notch1 intracellular domain)，可抑制下游PTEN分子的活性，說明PLAC1和Furin之間的相互作用促進了乳腺癌的侵襲和轉移。這些發現都解釋了本研究中結腸癌組織PLAC1高表達與淋巴結轉移及惡性化進展有關。淋巴結轉移是惡性腫瘤轉移的一種主要的轉移方式，浸潤的腫瘤細胞穿過淋巴管壁，脫落后隨淋巴液被帶到匯流區淋巴結，并且以此為中心生長出同種腫瘤。另外，血清PLAC1水平與腫瘤組織中PLAC1蛋白表達量一致，高水平的血清PLAC1可以作為一個有用的生物標志物，用于跟蹤疾病進展。Ren等[14]學者通過GSEA富集分析證實，PLAC1與MTA3途徑、DNA修復、干擾素 α 反應、干擾素 γ 反應、同種異體移植排斥、自身免疫性甲狀腺疾病等都密切相關。MTA3通路在調節結腸癌的發生和發展中起重要作用，它可以促進癌細胞增殖、侵襲、遷移和細胞周期進程[15]。此外，在過去的幾十年里，DNA修復已經被報道對結腸癌有影響，并且具有較強的預測預后價值。而RNA聚合酶可能會加速癌癥的發生，因為它們是細胞癌變的必需因子，促使非編碼RNA過表達[16]。上述結果都解釋了PLAC1在結腸癌中可能是一個功能性分子，用于跟蹤結腸癌患者的疾病進展，而且血清PLAC1作為結腸癌生物標志物的應用值得進一步研究。

綜上所述，我們的研究發現PLAC1在結腸癌組織和血清中的表達量顯著升高，而且PLAC1高表達與淋巴結轉移及TNM分期升高有關，檢測血清PLAC1水平對于結腸癌診斷和預測淋巴結轉移風險都能夠提供一定的可參考信息。