GPR120對脂多糖誘導的胰島β細胞炎癥損傷及TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路的影響

吳廣飛，王星，王迪，劉波，劉俊茹，婁東輝，劉博偉

(秦皇島市第一醫院 內分泌科，河北 秦皇島 066000)

胰島β細胞功能受損是2型糖尿病發病的中心環節，造成胰島β細胞功能受損的原因主要是脂毒性和糖毒性[1]。深入探討胰島β細胞功能受損的分子生物學機制對2型糖尿病的治療有重要意義。胰島β細胞功能受損與免疫炎癥損傷密切相關[2]。2型糖尿病患者血清中脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)表達水平明顯升高[3]。既往研究[4-5]表明，LPS可激活Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/髓樣分化因子(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)/核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路，參與急慢性炎癥的激活，造成胰島β細胞功能受損。G蛋白偶聯受體120(G-protein coupled receptor 120，GPR120)以中長鏈脂肪酸為配體，在糖脂代謝和胰高血糖素樣肽(glucagon like peptide 1，GLP-1)信號轉導等過程中發揮重要作用[6]。有研究[7]發現，GPR120可以改善脂肪組織炎癥和胰島素抵抗。GPR120對胰島β細胞炎癥性損傷既往少有報道。本研究通過構建LPS誘導的胰島β細胞炎癥損傷模型，分析GPR120在胰島β細胞炎癥損傷中的作用及可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

胰島β細胞MIN6細胞株由舜冉(上海)生物科技有限公司提供(貨號YB-H0390)。DMEM培養基(貨號NS1123)、胰蛋白酶(NS1672)均購自南京生航生物技術有限公司。LPS購自美國Sigma公司(貨號L6529-1MG)；pcDNA3.1-GPR120由上海吉瑪公司提供(貨號P14905)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(貨號HZ0146)、凝膠快速制備試劑盒(貨號HZ00243)、CCK-8試劑盒(貨號HZ441423-1)和Annexin-V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號HZ-00101)均購自上海滬震實業有限公司。IL-6(貨號EK0411)、IL-1β(貨號EK0394)和TNF-α(貨號EK6820)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司。GPR120(貨號ab5712)、TLR4(貨號ab7778)、MyD88(貨號ab1004)、NF-κB p65(貨號ab1359)抗體和β-actin內參抗體(貨號ab1121)均購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養

MIN6細胞在含10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養液中進行培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中。當細胞融合度達80%時進行傳代，用胰蛋白酶消化，以1∶3傳代，每2 d更換1次培養液。

1.3 分組和慢病毒感染

將MIN6細胞分為control組(細胞用無血清培養液進行培養)、LPS組(細胞用含10 μg·ml-1LPS[8]的培養液進行培養)、LPS+control組(感染陰性對照慢病毒的細胞用10 μg·ml-1LPS培養液處理)、LPS+GPR120組(感染pcDNA3.1-GPR120慢病毒的細胞用10 μg·ml-1LPS培養液處理)，均干預1 d。當胰島β細胞密度為40 %時，在細胞中加入慢病毒，培養12 h 后棄去慢病毒液加入新鮮完全培養液，3 d后用嘌呤霉素篩選穩轉細胞株，檢測GPR120蛋白的表達水平。

1.4 蛋白質印跡法檢測GPR120 蛋白的表達水平

在細胞中加入細胞裂解液，冰上裂解20 min后再12 000 r·min-1離心15 min，收集細胞上清液。用BCA法檢測蛋白水平。經SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗(GPR120單克隆抗體，1∶500)，4 ℃過夜后棄去一抗，TBST洗膜3次。隨后室溫孵育二抗，2 h后棄去二抗，TBST洗膜3次。以β-actin作為內參，用ECL發光儀對蛋白進行成像，用Image J軟件分析灰度值。

1.5 CCK- 8法檢測MIN6細胞增殖情況

將對數生長期的MIN6細胞以1×104個·孔-1的密度接種于24孔板中，用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。細胞培養24 h后向每孔中添加10 μl CCK-8，培養4 h。用酶標儀在450 nm波長處讀取吸光度。

1.6 Annexin- V- FITC/PI流式細胞術檢測MIN6細胞凋亡情況

取對數生長期的MIN6細胞制成1×106個·ml-1的細胞懸液,隨后加入5 μl異硫氰酸熒光素，混勻后孵育15 min,再加入2.5 μl碘化丙啶孵育5 min,最后用流式細胞儀檢測凋亡率。

1.7 ELISA檢測IL- 6、IL- 1β和TNF- α水平

吸取細胞培養液，3 000 r·min-1離心20 min后取上清液，用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8 蛋白質印跡法檢測TLR4、MyD88、NF- κB p65蛋白的表達

檢測步驟同1.4。實驗過程中TLR4、MyD88、NF-κB p65抗體分別稀釋500、1 000、500倍。

1.9 統計學處理

應用SPSS 20.0統計軟件處理數據。計量資料以平均數±標準差表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組GPR120蛋白表達量的比較

LPS組GPR120蛋白相對表達量為0.34±0.06，明顯低于control組的1.18±0.12，差異有統計學意義(P<0.05)。LPS+GPR120組GPR120蛋白相對表達量為1.36±0.23，明顯高于LPS+control組的0.39±0.09，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 各組MIN6細胞增殖活力比較

4組間細胞活力的比較差異有統計學意義(F=23.786，P<0.001)，LPS組細胞增殖活力明顯低于control組(0.67±0.09vs1.23±0.10，P<0.001)，LPS+GPR120組細胞增殖活力明顯高于LPS+control組(1.45±0.17vs0.70±0.12，P<0.001)，見圖2。

2.3 各組MIN6細胞凋亡率比較

4組細胞凋亡率的比較差異有統計學意義(F=68.223，P<0.001)，LPS組細胞凋亡率明顯高于control組[(16.78±2.31)%vs(6.09±1.23)%，P<0.001]，LPS+GPR120組細胞凋亡率明顯低于LPS+control組[(6.34±1.55)%vs(20.13±3.98)%，P<0.001]，見圖3。

2.4 各組細胞上清液IL- 6、IL- 1β和TNF- α水平比較

4組細胞上清液IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較差異均有統計學意義(F值分別為12.090、31.786、19.241，均P<0.001)。LPS組細胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平分別為(96.89±8.76)、(76.00±13.23)、(56.23±8.78)pg·ml-1，均高于control組[(71.89±12.13)、(43.23±10.12)、(35.34±9.56)pg·ml-1，均P<0.001]。LPS+GPR120組IL-6、IL-1β和TNF-α水平分別為(96.89±8.76)、(51.11±9.72)、(40.12±7.09)pg·ml-1，均低于LPS+control組[(100.34±16.23)、(68.34±10.23)、(53.26±10.11)pg·ml-1，均P<0.001]。見圖4。

與control組比較，*P<0.05；與LPS+control組比較，#P<0.05圖1 各組GPR120蛋白表達量的比較

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖2 CCK-8法檢測各組細胞活力

2.5 各組TLR4/MyD88/NF- κB p65信號通路相關蛋白表達量的比較

4組細胞TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量的比較，差異均有統計學意義(F值分別為23.001、18.324、30.181，均P<0.001)。LPS組細胞TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量分別為0.60±0.12、0.57±0.09、0.67±0.13，均高于control組(0.23±0.05、0.24±0.08、0.32±0.09，均P<0.001)。LPS+GPR120組TLR4、MyD88、NF-κB p65相對表達量分別為0.31±0.06、0.37±0.04、0.39±0.03，均低于LPS+control組(0.60±0.08、0.63±0.06、0.68±0.09，均P<0.001)。見圖5。

3 討 論

慢性炎癥引起的胰島β細胞損傷在糖尿病的發病中起重要作用[2]。有研究[9]顯示，2型糖尿病患者胰島組織中炎癥細胞因子過表達，并且存在免疫細胞浸潤、胰島β細胞凋亡等現象。LPS是誘導炎癥發生的重要分子，LPS誘導胰島β細胞損傷模型是糖尿病體外研究的常用模型。本研究用LPS處理MIN6細胞后，MIN6細胞IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，并且細胞增殖能力下降、凋亡率明顯增高，這與既往報道[10-12]一致，說明本實驗成功建立了LPS誘導的胰島β細胞損傷模型。

GPR120是脂肪酸受體超家族中新的G蛋白偶聯受體成員，以中長鏈脂肪酸為配體[7]。在小腸內分泌細胞STC1中，中長鏈脂肪酸與GPR120結合后激活磷脂酶C分解磷脂酰肌醇二磷酸，生成三磷酸肌醇和二酰甘油，而三磷酸肌醇引發細胞內鈣信號，進而控制胰高血糖素樣肽1的釋放，調控胰島素分泌。另外，中長鏈脂肪酸與GPR120結合后還可以激活MAPK信號通路，調節細胞生長和功能，同時調控游離脂肪酸引起的細胞凋亡抑制[13]。GPR120還能夠啟動PI3K-Akt信號通路，誘導細胞增殖，抑制細胞凋亡[13]。GPR120在腸內分泌細胞、味蕾細胞、巨噬細胞、脂肪細胞和胰島β細胞中表達較多，可參與調解激素分泌、脂質生成和葡萄糖代謝等一系列代謝過程，作為潛在的、治療多種代謝疾病的靶點備受關注[7,14]。既往研究[15]發現，GPR120可以通過抑制巨噬細胞分泌環氧合酶-2和促進前列腺素E-2分泌等起到抗炎作用，在胰島素抵抗的發生中起重要作用。

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖3 Annexin-V-FITC/PI流式細胞術檢測各組凋亡率

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖4 ELISA法檢測各組細胞上清液中炎癥因子表達水平

與control組比較，*P<0.001；與LPS+control組比較，#P<0.001圖5 蛋白質印跡法檢測各組TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量

本研究發現，與LPS組相比，轉染pcDNA3.1-GPR120慢病毒后MIN6細胞增殖活力明顯增高、凋亡率下降，并且IL-6、IL-1β和TNF-α水平也明顯下降，說明GPR120可以逆轉LPS誘導的胰島β細胞炎癥損傷。類似的是，Wang等[16]發現激動GPR120可以通過胰十二指腸同源盒-1信號通路逆轉棕櫚酸誘導的MIN6細胞炎癥，并且改善了小鼠胰島β細胞功能。Oh等[17]也發現，GPR120激動劑CpdA可以改善2型糖尿病小鼠的胰島素抵抗、肝臟脂肪堆積。為了探尋GPR120的可能作用機制，本研究檢測了TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路相關蛋白的表達量。TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路是一條經典的炎癥信號通路，激活后可以誘導免疫炎癥損傷和細胞凋亡的發生，該通路與胰島β細胞損傷、2型糖尿病的發生和發展密切相關[18-19]。有研究[20]發現，LPS可以通過激活TLR4和p38 MAPK抑制巨噬細胞GPR120的表達。GPR120對TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路的調控作用既往少有報道。有研究[21]發現，GPR120可以通過IκB激酶β抑制NF-κB p65的表達。本研究結果顯示，轉染pcDNA3.1-GPR120慢病毒可以下調TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表達，提示GPR120抗LPS誘導胰島β細胞損傷的機制可能與該通路有關。通過GPR120開發新藥可能給糖尿病的治療帶來希望。

綜上所述，GPR120在LPS誘導的胰島β細胞炎癥損傷中發揮保護作用，其作用機制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路、促進細胞增殖和減少細胞凋亡有關。本研究結果提示，靶向GPR120可能會為2型糖尿病的治療帶來曙光。未來需要進一步闡明GPR120對TLR4/MyD88/NF-κB p65信號通路的調控機制。