異常表達(dá)的PVT1作為診斷標(biāo)志物預(yù)測(cè)重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒臨床結(jié)局的研究

張敏，鄭貴蘭

(曹縣人民醫(yī)院 普兒科，山東 菏澤 274400)

肺炎(pneumonia)是指發(fā)生在肺泡、肺間質(zhì)及終末氣道的炎癥反應(yīng)，多由病原微生物、理化因素以及藥物所致[1]。根據(jù)疾病的輕重程度，肺炎又分為輕癥肺炎與重癥肺炎[2]。前者癥狀輕微、預(yù)后良好；后者的病情往往是復(fù)雜多變，且常常伴隨著呼吸衰竭，如治療不當(dāng)或不及時(shí)，則病死率極高，是感染性疾病中最常見(jiàn)的死亡原因之一[3]。兒童的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，因而肺炎成為兒科疾病中常見(jiàn)的一種呼吸道疾病，并且一年四季均可發(fā)病。目前，臨床上對(duì)兒童重癥肺炎合并呼吸衰竭的治療主要采用抗感染治療和輔助通氣治療，但即便如此，仍有部分兒童因治療不當(dāng)或者漏診而死亡[4]。因此，尋找有診斷價(jià)值的生物標(biāo)志物對(duì)于疾病的診斷而言是極為有意義的。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的非編碼序列[5]。近年來(lái)，隨著DNA測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA在個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育、疾病的發(fā)生發(fā)展以及神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。LncRNA已被證實(shí)參與疾病的調(diào)控，而某些lncRNA也被證實(shí)與肺炎有關(guān)[6]。Zhou等[7]的研究顯示，lncRNA SNHG16通過(guò)與趨化因子CCL5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miR-146a-5p，進(jìn)而介導(dǎo)JNK信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路調(diào)控脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞(人胚肺細(xì)胞)炎癥損傷，為肺炎的診斷和治療提供了新的思路。Chen等[8]的研究證實(shí)，lncRNA RP11-248E9.5和RP11-456D7.1對(duì)兒童肺炎有較高的診斷價(jià)值。LncRNA PVT1位于染色體8q24[9]，作為一種重要的致癌基因，PVT1已被證實(shí)在肺癌、肝癌、乳腺癌等實(shí)體癌癥中異常表達(dá)[10-12]。研究[13]表明，PVT1在膿毒癥大鼠的心肌組織中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的分泌加速抑制心功能。PVT1在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中表達(dá)增加，并與IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)，PVT1通過(guò)活化肺成纖維細(xì)胞促進(jìn)肺纖維化[14]。基于以上研究，我們推測(cè)PVT1可能在肺炎中發(fā)揮一定的作用。因此，本研究試圖通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PVT1在重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒血清中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步評(píng)估PVT1對(duì)該病的診斷及預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究人群和樣本采集

本研究共招募82例來(lái)本院就診并確診為重癥肺炎合并呼吸衰竭的患兒(疾病組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)滿足美國(guó)兒科感染性疾病學(xué)會(huì)/美國(guó)感染性疾病學(xué)會(huì)(IDS/IDSA)重癥肺炎診斷指南的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[15]；(2)滿足呼吸疾病中呼吸衰竭的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)呼吸衰竭僅由重癥肺炎誘發(fā)所致，患兒可接受機(jī)械通氣治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有其他的器官或系統(tǒng)感染的患兒；(2)嚴(yán)重肝腎功能不全的患兒；(3)患有免疫系統(tǒng)疾病的患兒；(4)惡性腫瘤患兒。另選取來(lái)本院進(jìn)行體檢的健康兒童作為健康對(duì)照組。本研究遵循《赫爾辛基宣言》中關(guān)于人體研究的倫理原則，并已得到曹縣人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。本方案招募的所有受試兒童的監(jiān)護(hù)人均已簽署書(shū)面知情同意書(shū)。在獲得知情同意后，對(duì)納入到本研究的所有兒童進(jìn)行一般臨床資料的采集及匯總，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)等。采集所有受試者的外周靜脈血于抗凝管中，檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)；血液離心后收集上層血清置于-80 ℃保存，備用。

1.2 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT- PCR)

根據(jù)TRIzol(Invitrogen，美國(guó))的說(shuō)明書(shū)上的方法及步驟進(jìn)行總RNA的提取，然后使用TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen，美國(guó))將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用miScript SYBR?Green PCR試劑盒(Qiagen GmbH，德國(guó))和SYBR green I Master Mix 試劑盒(Invitrogen,USA)在qRT-PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH和U6作為內(nèi)參并以2-ΔΔCt法對(duì)PVT1及miR-16-5p的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算。

1.3 隨訪方案及內(nèi)容

通過(guò)為期28 d隨訪調(diào)查記錄在隨訪時(shí)間內(nèi)患兒發(fā)生死亡事件的情況，并在隨訪結(jié)束后繪制患兒發(fā)生不良事件的生存曲線，評(píng)估PVT1的表達(dá)水平與預(yù)后之間的關(guān)系。

1.4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

使用StarBase V 2.0在線程序進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-16-5p與人類(lèi)PVT1基因轉(zhuǎn)錄本的3′-UTR區(qū)具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，隨后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)對(duì)此進(jìn)行驗(yàn)證。首先，將PVT1的3′-UTR序列片段克隆到psiCHECK-2熒光素酶報(bào)告基因載體中，構(gòu)建野生型(wild-type)報(bào)告載體PVT1-3′-UTR和突變型(mutant-type)報(bào)告載體PVT1-3′-UTR。將A549細(xì)胞以1×105個(gè)·孔-1的密度接種于24孔板中并培養(yǎng)過(guò)夜，直至每孔細(xì)胞密度達(dá)到60%以上。隨后根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國(guó))分別將上述載體和miR-NC、inhibitor NC、miR-16-5p mimic或miR-16-5p inhibitor共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Promega，美國(guó))測(cè)定各組熒光素酶活性。海腎熒光素酶作為對(duì)照基因。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS 21.0(SPSS，美國(guó))和GraphPad Prism 7.0(GraphPad Software，美國(guó))進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，分類(lèi)變量間比較采用卡方檢驗(yàn)；ROC曲線評(píng)估PVT1、miR-16-5p在重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒中的診斷價(jià)值；Pearson相關(guān)系數(shù)分析連續(xù)變量之間的相關(guān)性；Kaplan-Meier曲線及Log-rank法檢驗(yàn)PVT1對(duì)患兒不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人口及臨床資料

受試者的一般資料及臨床數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。兩組受試者在性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而疾病組的中性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、乳酸脫氫酶、淋巴細(xì)胞及降鈣素原水平均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.001)。

表1 兩組間人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征Tab 1 Demographic and clinical characteristics between two groups

2.2 疾病組血清PVT1、miR- 16- 5p的表達(dá)水平及二者相關(guān)性分析

采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)疾病組與健康對(duì)照組受試者的血清PVT1和miR-16-5p水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比較，疾病組患兒血清PVT1的水平顯著升高(P<0.001，圖1A)，而miR-16-5p的水平則明顯降低(P<0.001，圖1B)。疾病組與健康對(duì)照組的PVT1和miR-16-5p的差異表達(dá)說(shuō)明在重癥肺炎合并呼吸衰竭的過(guò)程中PVT1和miR-16-5p可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。另外，Pearson相關(guān)分析證實(shí)，疾病組患兒血清miR-16-5p水平與PVT1水平呈顯著負(fù)相關(guān)性(r=-0.734 3，P<0.000 1，圖1C)。

2.3 PVT1與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

本研究采用Pearson相關(guān)系數(shù)法評(píng)估PVT1與患兒各項(xiàng)臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果顯示，PVT1的表達(dá)水平與患兒的中性粒細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、淋巴細(xì)胞以及降鈣素原的水平呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性(P<0.05，表2)，表明PVT1的水平與患兒的疾病嚴(yán)重程度有關(guān)。

表2 PVT1與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性Tab 2 Correlation between PVT1 and various indicators

2.4 血清PVT1及miR- 16- 5p的診斷價(jià)值分析

在本研究中，我們采用ROC曲線評(píng)估了PVT1、miR-16-5p以及二者聯(lián)合對(duì)疾病的診斷意義。結(jié)果見(jiàn)圖2A～C，PVT1、miR-16-5p以及二者聯(lián)合的ROC曲線具有相近并且較高的AUC值、敏感度和特異度，對(duì)疾病診斷具有較高的臨床價(jià)值。以上結(jié)果表明單獨(dú)PVT1和單獨(dú)miR-16-5p均具有區(qū)分患兒和健康人群的能力，二者聯(lián)合并未觀察到診斷價(jià)值提高或者降低的現(xiàn)象。

A.兩組血清PVT1的相對(duì)表達(dá)量(***P<0.001)；B.兩組血清miR-16-5p的相對(duì)表達(dá)量(***P<0.001)；C.Pearson相關(guān)系數(shù)分析疾病組患兒血清PVT1與miR-16-5p的相關(guān)性圖1 PVT1、miR-16-5p的表達(dá)水平及相關(guān)性分析A.Relative expression of PVT1 in serum of two groups(***P<0.001);B.Relative expression level of miR-16-5p in serum of two groups(***P<0.001);C.The correlation between the expression level of miR-185-5p and PVT1 in disease groupFig 1 Expression level and correlation analysis of PVT1 and miR-16-5p

2.5 PVT1對(duì)重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒不良預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

本研究根據(jù)疾病組所有患兒血清PVT1的平均表達(dá)水平，將患兒分為PVT1高表達(dá)組(n=47)和PVT1低表達(dá)組(n=35)，并根據(jù)患兒在28 d隨訪期間內(nèi)發(fā)生死亡事件的情況繪制Kaplan-Meier生存曲線，通過(guò)分析PVT1的表達(dá)與患兒發(fā)生死亡事件的關(guān)系，評(píng)估PVT1對(duì)兒童重癥肺炎合并呼吸衰竭的預(yù)后價(jià)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PVT1高表達(dá)組患兒出現(xiàn)死亡事件的概率顯著高于PVT1低表達(dá)組(Log-rankP=0.014，圖3)。

A.LncRNA PVT1的ROC曲線；B.miR-16-5p的ROC曲線；C.LncRNA PVT1和miR-16-5p的ROC曲線圖2 PVT1、miR-16-5p及二者聯(lián)合對(duì)疾病的診斷價(jià)值分析A.ROC curve of LncRNA PVT1;B.ROC curve of miR-16-5p;C.ROC curve of LncRNA PVT1 plus miR-16-5pFig 2 Diagnostic value analysis of PVT1,miR-16-5p and their combination for disease

圖3 不同PVT1表達(dá)水平的患兒Kaplan-Meier生存曲線分析Fig 3 Kaplan-Meier survival curve analysis of pediatric patients with different PVT1 expression levels

此外，我們通過(guò)多因素Cox回歸分析驗(yàn)證了PVT1以及各項(xiàng)臨床指標(biāo)與預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果如表3所示，PVT1(HR為3.274，95 %CI為1.173～9.143，P=0.024)、miR-16-5p(HR為0.142，95 %CI為0.178～0.955，P=0.039)均可作為重癥肺炎合并呼吸衰竭的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

表3 多因素Cox分析臨床特征與總生存率的關(guān)系Tab 3 Multivariate Cox analysis of the relationship between clinical features and overall survival rate

2.6 miR- 16- 5p直接靶向PVT1的3′- UTR區(qū)

線上數(shù)據(jù)庫(kù)StarBase V 2.0預(yù)測(cè)PVT1與miR-16-5p的3′-UTR區(qū)域有結(jié)合位點(diǎn)，二者的互補(bǔ)序列見(jiàn)圖4A。隨后，采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)Υ私Y(jié)果進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic后野生型PVT1-3′-UTR組的熒光素酶活性顯著降低，而轉(zhuǎn)染miR-16-5p inhibitor后顯示野生型PVT1-3′-UTR組的熒光素酶活性明顯增強(qiáng)(P<0.001，圖4B)。另外，對(duì)于突變型PVT1-3′-UTR組而言，不管是轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic還是轉(zhuǎn)染miR-16-5p inhibitor均對(duì)熒光素酶活性無(wú)影響。以上結(jié)果表明，PVT1直接與miR-16-5p結(jié)合并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)水平。

3 討 論

世界衛(wèi)生組織(WHO)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示全世界每年近30%的新生兒死于重癥肺炎，而受重癥肺炎影響的兒童大約是1.56億例[16]。肺炎的發(fā)病相對(duì)較為隱匿，常常缺乏較為典型的臨床表現(xiàn)與體征，因而往往容易被誤診為上呼吸道感染，最終導(dǎo)致病情延誤及惡化。重癥肺炎是一種嚴(yán)重的肺部炎癥，常常伴隨著呼吸功能的衰竭，嚴(yán)重者將會(huì)影響循環(huán)系統(tǒng)，甚至危及生命安全[17]。目前而言，關(guān)于重癥肺炎的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但已被確證的機(jī)制涉及免疫系統(tǒng)與炎癥反應(yīng)[18]。當(dāng)前臨床上對(duì)于重癥肺炎的治療主要集中在抗感染治療、輔助恢復(fù)呼吸功能以及免疫支持治療3個(gè)方面[19]。對(duì)于重癥肺炎患兒而言，正確的診斷并進(jìn)行積極的治療可有效地改善不良預(yù)后。

有研究[20-21]表明，PVT1作為致癌基因在癌癥患者的血液中表達(dá)升高，并且PVT1高表達(dá)患者的預(yù)后較差。另有研究[22]發(fā)現(xiàn)，PVT1在肺炎鏈球菌壞死性肺炎模型的組織中表達(dá)上調(diào)，而敲低PVT1后可抑制肺泡上皮細(xì)胞的凋亡及炎癥因子的生成。Liu等[23]報(bào)道，PVT1是膿毒癥患者發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。LncRNA通常作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA(competitive endogenous RNA)，microRNA的“分子海綿”(miRNA sponge)而抑制miRNA的表達(dá)從而發(fā)揮基因調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道[24]，過(guò)表達(dá)miR-16-5p在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷中通過(guò)靶向CXCR3發(fā)揮對(duì)肺損傷的保護(hù)作用。Yin等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)miR-16-5p的表達(dá)水平可抑制膿毒癥誘發(fā)的肺損傷，表現(xiàn)為抑制小鼠模型的肺組織水腫、抑制炎癥及細(xì)胞凋亡。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒血清PVT1水平顯著升高，而miR-16-5p水平則明顯降低。

A.miR-16-5p和PVT1的結(jié)合位點(diǎn)；B.轉(zhuǎn)染miR-16-5p mimic顯著抑制野生型PVT1 3′-UTR的熒光素酶活性，而miR-16-5p inhibitor則相反(***P<0.001)圖4 PVT1與miR-16-5p的靶向關(guān)系的驗(yàn)證A.The binding sites of miR-16-5p and PVT1;B.Transfection of miR-16-5p mimic significantly inhibited the luciferase activity of WT-PVT1 3′-UTR,while transfection with miR-16-5p inhibitor showed the opposite result(***P<0.001)Fig 4 Verification of the targeting relationship between PVT1 and miR-16-5p

這與之前發(fā)表的相關(guān)研究結(jié)果具有一致性。Pearson相關(guān)系數(shù)分析miR-16-5p的表達(dá)與PVT1的水平呈負(fù)相關(guān)性，而患兒的部分臨床病理指標(biāo)則與PVT1水平呈正相關(guān)。這說(shuō)明PVT1與miR-16-5p可能同時(shí)在重癥肺炎合并呼吸衰竭中發(fā)揮作用，且PVT1水平與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)聯(lián)。

大量研究證實(shí)lncRNA和miRNA有作為疾病診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛能。例如，Pan等[26]證實(shí)PVT1對(duì)早期結(jié)腸癌具有潛在的診斷價(jià)值，并且在癌組織中過(guò)表達(dá)PVT1預(yù)示著患者的預(yù)后較差。有研究[27]證實(shí)在社區(qū)獲得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)患者中，入院時(shí)高水平的miR-146a-5p和miR-16-5p與隨訪30 d時(shí)較低的死亡率相關(guān)，兩種miRNAs都可作為CAP患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究的ROC曲線分析結(jié)果顯示出PVT1和miR-16-5p對(duì)重癥肺炎合并呼吸衰竭患兒而言具有較高并且相似的診斷價(jià)值，同時(shí)，二者聯(lián)合的ROC曲線并未顯示出更優(yōu)秀的診斷價(jià)值，我們因此推測(cè)單獨(dú)的PVT1、miR-16-5p對(duì)疾病的診斷價(jià)值同二者聯(lián)合的診斷價(jià)值是近似的。此外，本研究進(jìn)行了為期28 d的隨訪調(diào)查，對(duì)患兒發(fā)生不良預(yù)后的情況進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)PVT1高表達(dá)患兒發(fā)生死亡事件的人數(shù)較多，同時(shí)多因素Cox回歸分析表明PVT1在重癥肺炎合并呼吸衰竭中是獨(dú)立的預(yù)后因子。說(shuō)明高表達(dá)PVT1的患兒具有較高的預(yù)后不良發(fā)生的概率。另外，我們通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)初步驗(yàn)證了PVT1與miR-16-5p的直接靶向作用，這一結(jié)果與二者的相關(guān)性結(jié)果是一致的。盡管我們憑借實(shí)驗(yàn)手段證明了PVT1對(duì)于疾病的診斷和預(yù)后價(jià)值，也初步驗(yàn)證了PVT1與miR-16-5p的結(jié)合，但是二者在重癥肺炎合并呼吸衰竭中的具體機(jī)制以及他們是如何對(duì)疾病進(jìn)行調(diào)控仍然是未知的，我們?nèi)孕枰诖私Y(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行深入的探討。

綜上所述，本研究證實(shí)在重癥肺炎合并呼吸衰竭兒童的血清中PVT1的表達(dá)增加，而miR-16-5p的表達(dá)減少，并且miR-16-5p的水平隨著PVT1水平的增加而降低。ROC曲線證明了PVT1作為生物標(biāo)志物對(duì)疾病診斷的臨床價(jià)值。另外，高表達(dá)的PVT1與患者的預(yù)后不良有關(guān)，且PVT1是重癥肺炎合并呼吸衰竭的獨(dú)立預(yù)后因子。因此，我們推測(cè)PVT1具有作為重癥肺炎合并呼吸衰竭臨床診斷和預(yù)后評(píng)估的潛在的生物標(biāo)志物的能力。