急性冠脈綜合征患者大顆粒HDL結合miR-33介導HDL趨炎化轉變

趙曉靜，劉樹理，張琳

(保定市第二醫(yī)院 老年病科，河北 保定 071000)

高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)在血漿中的水平被認為與心血管事件的發(fā)生風險密切相關，HDL水平越低心血管事件的發(fā)生風險越高[1-2]。HDL具有膽固醇逆轉運(reverse cholesterol transport,RCT)、抗炎、抗氧化等多種重要的心血管保護功能，因此過往認為升高HDL水平可作為心血管保護的治療靶點。但全球多個通過抑制血漿膽固醇酯轉移蛋白(cholesteryl ester transfer protein,CETP)來升高HDL-C水平的大型隊列研究均以失敗告終，其中的具體機制尚未清楚,可能的解釋為在不同的機體狀態(tài)下，HDL-C的水平并不能總是反映HDL的心血管保護效應。HDL的顆粒大小及顆粒中的成分如蛋白質、miRNA和脂質等均具有多樣性，在不同的疾病狀態(tài)下呈現(xiàn)動態(tài)的變化。在急性冠脈綜合征(acute coronary syndromes,ACS)等急性炎癥條件下，HDL的顆粒大小及顆粒成分發(fā)生改變，從而失去其心血管保護作用轉變?yōu)橼呇譎DL，但其中的趨炎化轉變機制尚不清楚，miR-33是一種內含子miRNA，與細胞膽固醇運輸?shù)幕虮磉_調控密切相關[3]。此外miR-33可靶向結合ABCG1，降低RCT[3-4]。HDL在循環(huán)系統(tǒng)中可充當microRNA的運輸載體，轉運特定的microRNA到特定細胞組織發(fā)揮作用[5]。本研究旨在探討ACS患者HDL大顆粒(L-HDL)運載的miR-33上調在介導HDL趨炎轉變中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

本研究納入2019年1月至2019年12月在本院心血管內科住院的男性ACS患者(ACS組)，并選擇同時間段無高血壓、無糖尿病、無血脂異常、無吸煙史等無心血管危險因素的健康體檢者作為對照組。患者的納入標準：入院診斷符合美國心臟病學會(American College of Cardiology,ACC)、美國心臟病協(xié)會(American Heart Association,AHA)和歐洲心臟病學會(European Society of Cardiology,ESC)發(fā)布的指南對ACS的診斷標準；年齡≥18歲。排除標準：(1)風心病、心肌病、肺心病、心臟瓣膜病等其他器質性心臟病；(2)合并嚴重感染；(3)嚴重慢性肝腎功能不全；(4)甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能低下、腫瘤、自身免疫性疾病、結締組織病、近2個月行大手術或發(fā)生外傷、燒傷及重大應激事件；(5)既往有調脂藥物應用史、抗氧化及非類固醇消炎鎮(zhèn)痛藥應用史；(6)有其他潛在的炎癥相關因素疾病；(7)年齡≥80歲。最終共納入48例ACS患者，52例健康體檢者，并抽取全血分離血漿。

1.2 耗材和試劑

Tris、NaCl、EDTA和碳酸氫銨購自上海生工公司，硅鈣水合物(calcium silicate hydrate，CSH)、佛波酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)均購自Sigma公司。Qiazol miRNAeasy Kits和miScript II RT Kit購自Qiagen公司。Luminex 200 assay(Milliplex Map Kit,Human Magnetic Bead,MAPmateTMBuffer Kit)和ox-LDL購自Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 一般資料和生化檢測 采集ACS組入院時及對照組體檢時的一般資料，包括年齡、BMI和血壓。ACS組入院時及對照組體檢時檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C、APOA1、ApoB、hsCRP、Insulin、HbA1c和GLU，上述生化指標均在本院檢驗科檢測。

1.3.2 HDL大中小顆粒分離及純化 本實驗采用快速蛋白液相色譜(fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC)法分離HDL大中小顆粒成分[6]。取500 μl血漿注入FPLC的進樣器中，加入標準Tris緩沖液(STB：10 mmol·L-1Tris，0.15 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA)，樣本以0.3 ml·min-1流速經過3個串聯(lián) Superdex 200凝膠過濾柱進行分離，最終用1.5 ml餾分收集器(GE Healthcar)收集洗脫液，并4 ℃保存。洗脫液用CSH進行純化，除去非HDL雜質，每0.5 ml洗脫液中每1 μg磷脂加入45 μg CSH，室溫下顛倒混合30 min；2 200×g離心2 min,CSH壓縮為球狀沉淀；棄上清，上清包含無磷脂的蛋白及其他CSH雜質用50 mmol·L-1碳酸氫銨進行清洗，得到所有含有磷脂的組分，純化完成。

1.3.3 miR-33水平測定 采用實時熒光定量PCR法檢測miR-33的表達水平，根據(jù)Qiazol miRNAeasy Kits說明書分別提取血漿和HDL大中小顆粒組分中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，超微量分光光度計Nonodrop 2000 檢測RNA濃度及純度，合格樣品定義為OD260 nm/280 nm為1.8～2.0，OD260 nm/230 nm>2。使用miScript II RT Kit進行miRNA逆轉錄生成cDNA。本實驗采用SYBR熒光法進行熒光定量PCR檢測，以U6為內參，檢測miR-33在血漿和HDL大中小顆粒組分中的表達水平。所需引物如下：miR-33 forward primer:5′-GGTTAGATCTTGCTCCAGCGGTTTG-3′,miR-33 reverse primer:5′-GTAAAGCTTGCCCTCCTGTTTCCTG-3′;U6forward primer:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;U6 reverse primer:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3。采集反應生成的循環(huán)閾值(Ct值)，按照2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

1.3.4 膽固醇流出測定 本研究采用3H標記膽固醇完成膽固醇流出實驗，分組如下：陰性對照組、recombination HDL(rHDL)組、L-HDL組、HDL中顆粒(M-HDL)組、HDL小顆粒(S-HDL)組和L-HDL+anti-miR33反義寡核苷酸(TGCAATGCAACTACAATGCAC)組(L-HDL+anti-miR33組)。THP-1巨噬細胞獲取：取生長狀態(tài)良好的THP-1細胞，按1×105個·孔-1均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，并加入160 nmol·L-1PMA，37 ℃共孵育48～72 h，誘導分化成巨噬細胞。將各組THP-1巨噬細胞加入3H-膽固醇孵育液0.5 ml·孔-1，37 ℃培養(yǎng)24 h。3H-膽固醇標記24 h后棄去膽固醇孵育液，用無血清培養(yǎng)基洗板3次，隨后加入同步液繼續(xù)培養(yǎng)2 h。同步化2 h后用無血清培基洗板3次，分別加入上述各組含HDL的膽固醇誘導流出液500 μl，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)4 h后收集培養(yǎng)液到EP管中，4 000 r·min-1離心10 min，取上清為3H-膽固醇流出液。繼而用PBS清洗3次，加入0.1%的Triton-X100，充分吹打、振蕩至少1 h，收集裂解液到EP管中；液體閃爍計數(shù)器計數(shù)并統(tǒng)計。膽固醇流出量按膽固醇流出液中3H放射性計量占膽固醇流出液及細胞內液中3H總量的百分比計算。

1.3.5 抗炎能力測定 泡沫細胞模型誘導：THP-1細胞按1×105個·孔-1均勻接種于6孔培養(yǎng)板中，用160 nmol·L-1的PMA和100 μg·ml-1的ox-LDL共孵育，使其分化為巨噬細胞，進而模擬泡沫細胞[7]，分組如下：陰性對照組、rHDL組、L-HDL組、M-HDL組、S-HDL組和L-HDL+anti-miR33組。將含上述分組HDL500 μl的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)THP-1泡沫細胞24 h，收集細胞上清，采用Luminex 200 assay檢測TNF-α、IL-1β和MCP-1等炎癥因子的表達。

1.4 統(tǒng)計學處理

本研究結果以平均值±標準差的方式表示，使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析及GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖。針對多個樣本差異比較，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用單因素ANOVA分析，并以Bonferroni法進行兩兩比較；若不符合，則采用Kruskal-Wallis檢驗分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 ACS組與對照組臨床基線資料比較

兩組之間年齡、收縮壓、TG、ApoA1、HbA1c和GLU比較差異無統(tǒng)計學意義。ACS組血脂相關指標如TC、LDL-C、ApoB，炎癥相關指標hsCRP，糖代謝相關指標胰島素水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組HDL-C水平差異無統(tǒng)計學意義。此外，ACS組血漿中miR-33相對表達水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ACS組與對照組臨床基線資料比較Tab 1 Comparison of clinical data between ACS group and Healthy group

2.2 FPLC分離血漿HDL

應用3個Superdex 200串聯(lián)凝膠過濾層析柱收集，極低密度脂蛋白(VLDL)與LDL位于同一個峰值，故收集46～58組分為VLDL/LDL，收集60～77組分為HDL，其中60～65組分混合為L-HDL，66～71組分混合為M-HDL，72～77組分混合為S-HDL，最后分離出來的成分是白蛋白，見圖1。

圖1 FPLC分離血漿HDL分離譜Fig 1 Lipoprotein separation profile by FPLC

2.3 兩組HDL亞組分中miR- 33的相對表達水平比較

采用實時熒光定量PCR檢測兩組HDL各亞組分中miR-33的相對表達水平如下：ACS組中L-HDL為6.10±0.61，M-HDL為2.01±0.32，S-HDL為1.4±0.18；對照組中L-HDL為2.30±0.45，M-HDL為1.41±0.17，S-HDL為1.01±0.09。兩組中相對應HDL亞組分之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；此外使用反義寡核苷酸后ACS組L-HDL上miR-33的相對表達水平為2.68±0.28，與未使用反義寡核苷酸ACS組之間的結果差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 ACS組和對照組HDL各亞組分中miR-33相對表達水平Fig 2 The expression of miR-33 in different HDL subfraction between ACS group and controll group

2.4 HDL結合miR- 33對HDL膽固醇流出功能的影響

3H膽固醇流出功能測定實驗結果顯示，與對照組相比，ACS組患者各亞組分HDL的膽固醇流出能力均有不同程度的下降，尤其是L-HDL組(P<0.05)。用反義核苷酸抑制miR-33后，ACS組L-HDL組的膽固醇流出能力顯著增高(P<0.05)。見圖3。

圖3 HDL結合miR-33對HDL膽固醇流出功能的影響Fig 3 Effects of HDL combined with miR-33 on HDL cholesterol effluent function

2.5 HDL結合miR- 33對HDL抗炎能力的影響

通過Luminex 200實驗檢測炎癥因子TNF-α、IL-1β和MCP-1在THP-1泡沫細胞中的表達，表達水平越高說明該組HDL亞組分的抗炎能力越低。結果顯示：(1)ACS組TNF-α在L-HDL組表達水平為(112.86±10.51)pg·ml-1，L-HDL+anti-miR33組表達水平為(78.56±5.79)pg·ml-1，對照組中TNF-α在上述亞組中的表達水平分別為(60.46±8.29)、(50.02±4.22)pg·ml-1，ACS組和對照組中L-HDL組和L-HDL+anti-miR33組的TNF-α表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(2)ACS組IL-1β在L-HDL組表達水平為(178.34±7.54)pg·ml-1，L-HDL+anti-miR33組表達水平為(138.24±6.77)pg·ml-1，對照組中IL-1β在上述亞組中的表達水平分別為(103.32±4.76)、(90.16±5.65)pg·ml-1，ACS組和對照組中L-HDL組和L-HDL+anti-miR33組的IL-1β表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(3)ACS組MCP-1在L-HDL組表達水平為(428.70±10.85)pg·ml-1，L-HDL+anti-miR33組表達水平為(322.78±10.85)pg·ml-1，對照組中IL-1β在上述亞組中的表達水平分別為(294.02±14.051)、(272.14±9.14)pg·ml-1，ACS組和對照組中L-HDL組和L-HDL+anti-miR33組的MCP-1表達水平差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 HDL結合miR-33對HDL抗炎能力的影響Fig 4 Effects of HDL combined with miR-33 on HDL anti-inflammatory function

3 討 論

血漿HDL-C水平與動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease，ASCVD)風險呈負相關。但通過抑制CETP酶等方法增加血漿HDL-C水平并不能降低動脈粥樣硬化性心臟病的風險，因此研究重點已然從HDL水平轉到HDL功能。HDL直徑大小范圍在8～10 nm[8]，在人體循環(huán)系統(tǒng)中充當一個納米顆粒載體，運載大量的蛋白質、脂質及miRNA等分子，發(fā)揮膽固醇逆轉運、抑制脂質氧化、恢復內皮功能、抗炎和抗凋亡等抗動脈粥樣硬化的作用。近年來，大量研究表明在機體急性或者慢性炎癥狀態(tài)下，HDL的功能會發(fā)生改變，轉變?yōu)楣δ苁д{性HDL或者是趨炎性HDL[9]，失去其抗動脈粥樣硬化的能力，具體機制尚未闡明，可能是因為炎癥狀態(tài)下HDL顆粒上攜帶的分子發(fā)生動態(tài)改變。本研究中ACS患者血漿炎癥因子水平均明顯高于對照組，說明患者發(fā)生ACS后機體處于一個急性炎癥狀態(tài)。我們進一步通過FPLC純化兩組HDL亞組分，觀察ACS所致的急性炎癥狀態(tài)是否影響HDL各亞組分的功能。通過體外的膽固醇流出實驗、炎癥因子表達檢測實驗發(fā)現(xiàn)，ACS患者的HDL各亞組分膽固醇流出能力及抗炎能力均受損，尤其是L-HDL組。我們需要進一步探討ACS患者L-HDL功能受損及促進炎癥因子釋放的具體機制。

miRNAs是參與大部分生物過程的關鍵調控因子和許多疾病的重要治療靶點。研究[10]表明,miR-33在脂代謝及促動脈粥樣硬化中發(fā)揮調控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，ACS患者血漿中miR-33的水平明顯高于對照組，ACS組分離純化后各HDL亞組分結合的miR-33水平均顯著高于對照組，尤其是L-HDL組。HDL可結合轉運多種分子作用于心血管，而miRNAs是其中一種[11]。HDL結合miR-33水平增多對HDL功能的影響是我們關注的重點。我們通過反義寡核苷酸高親和力特異性結合miR-33，降低L-HDL結合miR-33的水平，抑制miR-33的活性。我們的研究結果表明,抑制L-HDL結合miR-33后L-HDL的膽固醇流出功能和抗炎能力均相對恢復，說明L-HDL結合的miR-33水平增加可影響HDL的抗動脈粥樣硬化功能，促進炎癥因子釋放，介導L-HDL的趨炎化改變。如果單純通過藥物增加體內HDL-C的水平而不改善HDL的功能，增加的都是趨炎化失功能的HDL，不僅無法抗動脈粥樣硬化，還可能會進一步促動脈粥樣硬化。越來越多的證據(jù)[12-14]表明，中風、心力衰竭和心肌梗死等重大心血管疾病的發(fā)生與HDL的功能受損密切相關。因此,如何改善HDL的功能應該是我們防控動脈粥樣硬化及心血管事件的重中之重。本研究關注ACS患者HDL結合miR-33水平變化介導HDL功能受損，但HDL結合miR-33通過何種方式促進炎癥及抑制膽固醇流出還需進一步探討。

本研究創(chuàng)新點在于探討病理條件下HDL顆粒結構成分的動態(tài)改變，通過FPLC分子篩溫柔地純化出疾病狀態(tài)下的HDL，較高程度地還原體內真實的HDL，使我們能夠更好地理解可能導致HDL功能喪失的潛在變化。我們需要進一步找到潛在干預靶點，以恢復HDL功能或增強特定的保護功能。對HDL結構和功能的研究，旨在設計和開發(fā)不同重組HDL配方，以克服在不同的疾病條件下HDL相關功能的改變，以獲得在體內長期保持穩(wěn)定和有效的HDL結構，并更接近健康和天然的HDL顆粒，才更具有心血管益處。