基于CRISPR建立“精確引導的昆蟲不育技術”平臺大幅提高致死效率

斑翅果蠅是一種入侵世界諸多地區的作物害蟲，對水果生產造成了重大的農業和經濟損失。斑翅果蠅將卵深深地產在不腐爛的成熟果實的軟肉中，導致果實損壞，且限制了噴霧式殺蟲劑的有效性。櫻桃、覆盆子、黑莓、藍莓、草莓、桃子、李子、油桃、葡萄，橄欖、西紅柿、獼猴桃、無花果和蘋果都被發現受其危害。2008年，在美國加利福尼亞州、俄勒岡州和華盛頓州，斑翅果蠅導致的損失估計50億美元。

目前用于抑制斑翅果蠅種群的主要方式是殺蟲劑。然而，越來越多的證據表明，斑翅果蠅正在對殺蟲劑產生有可能廣泛的抗藥性。考慮到這些非特異性廣譜殺蟲劑對環境的影響，尋找環境友好的害蟲管理方法十分必要。

近日，加州大學圣地亞哥分校的研究人員將基于CRISPR的新技術應用在了斑翅果蠅的控制上。

該校生物科學學院細胞與發育生物學系教授阿卡巴里和肯多爾等其他研究人員于2019年首次在普通果蠅中展示了“精確引導的昆蟲不育技術”。該方法使用可編程的CRISPR技術來編輯控制昆蟲性別決定和生育能力的關鍵基因，后來也被證明適用于蚊子。

阿卡巴里共同創立了生物技術公司Agragene，該公司已從加州大學Riverside分校（Akbari最初領導該技術的開發）獲得了pgSIT基礎技術許可，并正在實施由美國農業部管理的pgSIT田間試驗。該公司希望這些試驗能夠證明pgSIT的安全性和有效性，并能通過監管部門批準，以在農業上廣泛應用。

pgSIT開發的昆蟲卵被部署到目標種群中，只有不育的雄性昆蟲才能孵化；不育雄性交配后產生的后代不育，從而達到抑制種群數量的目標。

“這是一個安全、進化穩定的系統。”阿卡巴里說，“此外，該系統不會導致不受控制的傳播，也不會在環境中持續存在——這兩項重要的安全保障都將有助于其獲得使用批準。”

昆蟲不育技術（SIT）已經使用了半個多世紀。而其背后的概念可以追溯到20世紀30年代，當時農民找到了將不育雄性釋放到田間以減少害蟲的方法。到本世紀中葉，美國農民開始使用紫外線輻射對螺旋錐蠅進行不育誘導。

SIT一般通過反復釋放絕育的雄性昆蟲來抑制種群，這些不育的雄性將與野生雄性競爭，以與野生雌性交配。為了有效地利用昆蟲不育技術，理想的解決方案是：（1）大規模飼養昆蟲，（2）對雌性進行有效的遺傳選擇，（3）確保雄性不育，（4）培育具備環境適應力和性競爭力的雄性，（5）具有成本效益的運輸和部署、田間投放措施。

傳統SIT利用DNA損傷（如紫外線輻射）來產生絕育雄性，因此需要按照較大的雄/雌比例釋放雄性才能抑制當地種群。

而阿卡巴里之前通過普通果蠅和埃及伊蚊開發的基于下一代昆蟲不育技術的方法，稱為“精確引導昆蟲不育技術（pgSIT）”，利用CRISPR/Cas9技術對導致雌性致死性和雄性不育的特定基因突變位點進行編程誘導。

如上圖所示，圖A展示了經典SIT依靠輻射對蛹或成年蒼蠅進行絕育，然后去除其中雌性，釋放雄性。結果，在環境中釋放的每只雄性都以一倍的比例規模進行飼養、絕育和性別分類。

SIT和pgSIT的比較

而在pgSIT中，如圖B所示，含有Cas9和gRNA的親本之間進行雜交，靶向對雌性生存能力和雄性生育能力至關重要的基因導，從而導致靶向基因的破壞，以達到雌性致死和子代中的雄性不育。每個親本雌性可以產生多達300個后代，其中50%將是絕育的雄性，也就是每個雌性產生150個不育雄性。

這使得pgSIT潛在的擴展優勢為150倍。此外，傳統的SIT需要處理和釋放成年雄性，人工操作大大提高了其成本。而使用pgSIT，卵可以直接在環境中部署和孵化，從而消除了手動釋放不育雄性的需求。

而在該研究中，他們設計了一個針對斑翅果蠅的pgSIT系統，可用于產生有競爭力的不育雄性。正如所設想的那樣，經過pgSIT處理的卵可以在實驗室生產，在被害蟲入侵的地點釋放。大約兩周后，只有不育的雄性才會孵化。由于只有兩個基因被敲除，雄性顯得足夠健康，可以與野生雄性進行競爭，并迅速尋找雌性交配，從而產生不可育的后代。

值得注意的是，在某些株系中，其pgSIT 技術可以產生高達100%的不育雄性，所有雌性都死亡或轉化為雙性。不過，盡管有這些顯著的結果，并非所有都完美，這可能取決于多種因素，包括Cas9的maternal deposition和其他未開發的因素，例如轉基因插入位置和/或gRNA靶序列。鑒于這些結果，有可能通過靶向其他基因來進一步改善該系統。

“這項技術將取代對殺蟲劑的需求”阿卡巴里說，“在過去的四年里，我們為幾個不同的物種開發了 pgSIT。展望未來，我們希望將其用作平臺技術，可以移植到各種害蟲中去，以安全地解決現實世界的問題。”