不同綿羊品種雜交羔羊肉品質分析與嫩度基因mRNA表達驗證

孫國虎，牛小瑩，白雅琴，霍子東，魏曉云 ,羅 蘭

（1.甘肅省畜牧技術推廣總站，甘肅 蘭州 730030；2.甘南州畜牧技術服務中心，甘南 合作 747000；3.新疆維吾爾自治區畜牧總站，新疆 烏魯木齊 830000）

隨著人們生活水平的提高，生活條件的改善，羊肉人均需求量不斷增加。嫩度、多汁性和風味是決定羊肉品質的重要指標，羊肉肌內脂肪（intramuscular fat,IMF）含量高低決定嫩度、多汁性和風味等肉質性狀的優劣，心型脂肪酸結合蛋白（Heart Fatty Acid Binding Protein,H-FABP）基因是羊肉肌內脂肪的候選基因，是一種胞漿蛋白，分子質量較小，在脂類代謝過程中起著重要作用，被稱為轉運蛋白[1]。我國現有肉羊品種大多肌肉中的H-FABP mRNA含量較低，肉質較差，本試驗以黃土高原、青藏高原農牧交錯帶馴化繁育的湖羊為母本、國外肉羊品種為父本進行雜交生產的羔羊為研究對象，測定H-FABP mRNA在肉質中的相對表達量以及影響肉品質的相關指標，為甘肅省肉羊雜交改良提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

提供1月齡、體重相近，健康水平一致的杜泊與湖羊雜種一代羔羊10只、澳洲白與湖羊的雜種一代羔羊10只、薩福克與湖羊的雜種一代羔羊10只、特克塞爾與湖羊的雜種一代羔羊10只。

1.2 主要試劑

DEPC原液、Trizol、Tris、Tris 飽和酚、EDTA、異丙醇、乙醇、RNase-free water、DNase I、RNA Inhibitor（TaKaRa）、TIANScript RT kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master、GoldView 核酸染料、20 bp DNA Ladder Marker，以上試劑均來自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 主要儀器

嫩度測定儀（型號C-LM3B），恒溫水浴鍋（型號EMS-20），溫度計，經改裝的應變式無側限壓力儀（型號WW-2A），專用肉質測定pH計（型號HI221），電熱恒溫鼓風干燥箱(型號SKFG-01B），以上儀器均來自上海標隆儀器有限公司。電泳儀（型號DYY-III2）購自北京六一生物科技有限公司，臺式高速冷凍離心機（型號BBT2-MIKRO 22R）購自北京海富達科技有限公司，除熒光定量PCR儀（型號ABI7500）購自鄭州博邦科貿有限公司。

表1 試驗羊只飼料配方及日糧營養水平

1.4 試驗設計

1.4.1 羊只飼養管理 所有試驗羊只在同一營養水平、同一環境下飼養至4月齡進行屠宰。試驗日糧按預期日增重300 g的營養需求量進行配方設計，飼料原料中粗蛋白質、鈣、磷、粗纖維和代謝能含量用實測值，按配方加工成粉料，粗飼料為青貯玉米，不同階段精飼料配方、營養水平與飼喂量見表1。入舍前，對所有羊只進行免疫、驅蟲和健胃，對試驗羊舍、羊欄、食槽等進行多次消毒。

1.4.2 樣品采集 試驗羊只屠宰后2 h內取其背最長肌、半腱肌，將組織樣真空包裝2份，分別在0～4 ℃成熟1 d、3 d，將成熟后的半腱肌和背最長肌各50 g放入液氮中帶回實驗室，然后置入-70 ℃低溫保存。

1.4.3 肉品質與H-FABP mRNA含量的測定 測定pH值、失水率、蒸煮損失、剪切力、熟肉率以及半腱肌和背最長肌2個組織部位H-FABP mRNA的相對量。

1.4.4 設計引物與選擇內參基因 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成以持家基因β-actin為內參、以綿羊H-FABP和β-actin mRNA為序列的引物（表2）。

1.4.5 數據統計分析 采用SPSS 11.5軟件對試驗數據進行統計分析，基因表達量均采用2-ΔΔCt法處理數據[2]，所有試驗數據以平均值±標準差表示，采用Duncan法對試驗結果進行差異顯著性分析。

表2 擴增的H-FABP和β-actin基因相關引物參數

表3 不同雜交組合肉品質測定結果

2 結果與分析

2.1 不同雜交組合羔羊肉質性狀差異性分析

由表3可知，4個類群雜交羔羊肉質pH值在成熟第1天與第3天均無顯著差異（P＞0.05），成熟第1天杜湖雜交羔羊肉的失水率顯著低于澳湖、特湖雜交羔羊肉（P〈0.05），而成熟第3天杜湖雜交羔羊肉的失水率極顯著低于其他3組雜交羔羊肉（P〈0.01）；特湖雜交羔羊肉成熟第1天的蒸煮損失極顯著高于其他3組雜交羔羊肉（P〈0.01），澳湖、特湖在第3天的蒸煮損失都極顯著高于其他2組雜交羔羊肉（P〈0.01）；杜湖雜交羔羊肉成熟第1天的剪切力和熟肉損失極顯著高于特湖和澳湖兩個雜交羔羊肉（P〈0.01），澳湖雜交羔羊肉成熟第3天的剪切力和熟肉損失極顯著低于杜湖雜交羔羊肉（P〈0.01）。

2.2 H-FABP基因RT-PCR擴增

以綿羊背最長肌組織總RNA為模板，用所設計的β-actin和H-FABP引物分別進行RTPCR擴增，PCR產物經1%聚丙烯酰胺凝膠電泳，分別獲得153 bp、124 bp的條帶（圖1、圖2）。

圖1 雜交羔羊β-actin基因擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖（153 bp）

圖2 雜交羔羊H-FABP基因擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳圖（124 bp）

2.3 H-FABP基因mRNA的相對表達量分析

通過實時熒光定量PCR對4個類群雜交羔羊的背最長肌和半腱肌2個組織部位H-FABP基因mRNA進行了相對表達量分析（圖3）。對于同一品種雜交羔羊不同組織部位來說，H-FABP基因mRNA在不同組織中均有表達，在半腱肌的相對表達量高于背最長肌。對于同一組織部位不同品種雜交羔羊來說，澳湖雜交羔羊背最長肌中的H-FABP基因mRNA相對表達量顯著高于其他品種（P〈0.05），澳湖、薩湖雜交羔羊半腱肌中的H-FABP基因mRNA相對表達量極顯著高于特湖、杜湖雜交羔羊（P〈0.01），薩湖雜交羔羊半腱肌中的H-FABP基因mRNA相對表達量極顯著高于澳湖雜交羔羊（P〈0.01）。

圖3 H-FABP基因mRNA在不同雜交羔羊不同部位的相對表達量

3 討論

湖羊具有繁殖率高、產奶量高等特點，引進國外肉羊作為父本與湖羊進行雜交，其羔羊生產性能明顯高于純種湖羊羔羊。澳洲白綿羊是由白杜泊綿羊、萬瑞綿羊、美利奴羊等經過選育形成的特有品種，繼承了這些肉羊的優良基因。其最明顯的特點是體型高大、生長速度快、成熟早、常年發情，是與湖羊和小尾寒羊雜交較理想的父本[3]。本試驗結果表明，4個品種雜交羔羊肉質pH值在成熟第1天與第3天均無顯著差異（P＞0.05）。王明晏等[4]等認為，羔羊宰后24 h測定pH值在5.46～5.76之間，本試驗結果與其相一致。成熟第1天杜湖、薩湖雜交羔羊的失水率顯著低于澳湖、特湖雜交羔羊肉（P〈0.05），而孔令旋[5]等研究結果表明澳湖、杜湖兩組雜交組合Fl代熟肉率在數值上有所提高，較湖羊的吸水性好，保鮮能力強，但組間差異不顯著，這與本試驗結果不一致，有待進一步研究。成熟第3天杜湖雜交羔羊肉的失水率極顯著低于其他3個雜交羔羊肉（P〈0.01），杜湖雜交羔羊的肉質在成熟第1天與第3天的蒸煮損失均低于澳湖和特湖，而杜湖雜交羔羊肉在成熟第1天的剪切力極顯著高于其他3個雜交羔羊肉（P〈0.01）。張麗娜[6]等研究結果表明，羊的生長發育特性、生產性能與其遺傳特性密切相關，且雜交羔羊的生長發育速度顯著高于純種羔羊。徐鐵山等[7]和康建兵等[8]對杜湖、澳湖F1代羔羊的體尺與體重進行了相關分析，結果表明，體重與胸圍的相關性最大，體高、體斜長、管圍對體重的影響次之，且澳湖雜交羔羊的產肉性能優于杜湖和純繁湖羊。李旺平等[9]研究表明，澳杜湖羊的失水率最低、熟肉率最高。這與本試驗研究結果相一致。由此表明，澳洲白作為公羊與湖羊雜交是最理想的雜交組合模式。

影響肉質嫩度、多汁性及風味的主要成分是肌內脂肪中的甘油三酯[10-12]，它的含量是最直觀反應肉質優劣的的重要指標[13]。H-FABP基因在脂肪酸合成以及脂類代謝過程中起著重要作用，其原理是自身與脂肪酸結合后，在肌內脂肪氧化時溶解肌纖維束，從而提高肌肉嫩度和多汁性，因此被稱為轉運蛋白。研究H-FABP基因多態性對改善羊肉品質具有重大意義。喬海云等[14]研究表明，不同綿羊品種中H-FABP基因具有多態性。謝一妮等[15]在研究崇明島山羊群體時發現，H-FABP基因部分區域有SNPs單核苷酸多肽性，可以作為衡量肌肉中脂肪含量的候選基因。郝稱莉等[16]研究發現，湖羊肌肉組織中H-FABP基因mRNA的相對表達量與肌內中的脂肪含量呈正相關。本試驗研究發現，澳湖雜交羔羊背最長肌和半腱肌中的H-FABP基因mRNA相對表達量顯著高于其他雜交羔羊（P〈0.05），表明澳湖雜交羔羊的肉質脂肪含量高于杜湖、特湖和薩湖雜交羔羊。

4 結論

澳洲白作為公羊與湖羊雜交產生的羔羊其肉品質優于特克賽爾、杜泊和薩福克作為父本與湖羊雜交產生的羔羊肉品質。因此，澳洲白作為父本與湖羊雜交是理想的組合模式。