茶樹油對三種常見致病菌的體外抑菌活性研究

王桂榮，趙晨棟，王 萌，范碧玥，馬小燕，安志霞，趙鳳舞*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅 蘭州 730070；2.蘭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

茶樹油主要通過蒸餾，從各種桃金娘科白千層屬植物的葉子中提煉而來，原產(chǎn)于澳洲，主要有揮發(fā)油、三萜等成分，芳香氣味，還含有一些鞣質(zhì)、脂肪酸和脂類化合物等[1]，具有廣譜抗微生物的效果以及保健作用[2-5]，是能夠用于替代抗生素、緩解微生物耐藥現(xiàn)狀的一種天然的、優(yōu)良的抗菌劑，且無毒害[6-7]，已在多個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3]。金黃色葡萄球菌（Staphyloccus aureus）是一種重要的病原菌[6]。沙門氏菌（Salmonella）是食物中毒事件的主要致病菌之一[7]。大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通稱為大腸桿菌，寄居在動物腸道中，可以導(dǎo)致動物發(fā)生疾病，且具有多重耐藥性[8]。目前，微生物的耐藥性由于抗生素的濫用而逐年增強，因此尋找能夠代替抗生素、且對微生物敏感度高、不易使微生物產(chǎn)生耐藥性的抑菌物非常重要。本試驗選用金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌作為供試菌，茶樹油作為抑菌劑，進(jìn)行茶樹油體外抑菌試驗，測定茶樹油抑菌活性。同時通過分光光度法測定1.5×108cfu/ml（相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)）的菌懸液[9]在600 nm波長處的光密度值（optical density，OD），用OD值表示細(xì)菌菌懸液濃度，以驗證茶樹油對所選用的3種供試菌的抑制敏感度以及對其最小抑菌濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC）。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 金黃色葡萄球菌（ATCC25923），沙門氏菌（CMC50115），大腸埃希氏菌（ATCC25922），菌種保存于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院微生物實驗室。

1.1.2 試劑 蛋白胨、瓊脂粉、酵母提取物，均為生化試劑。吐溫-80溶液、氯化鈉、氫氧化鈉，均為分析純。試驗過程所用水為蒸餾水。

1.1.3 儀器與設(shè)備 紫外可見分光光度計（UV-5500），垂直層流潔凈工作臺（HCB-1300V），生化培養(yǎng)箱（HPX-Ⅱ-80），高壓蒸汽滅菌鍋（LDZH-100KBS），分析天平（Cubis Ⅱ）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 分別配制瓊脂液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基，配制完成后使用高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽（15 psi）滅菌20 min（1.05 kg/cm3），液體瓊脂培養(yǎng)基在高壓滅菌后，冷卻降溫放4 ℃條件下保存，以備后續(xù)制備菌懸液使用；固體培養(yǎng)基在溫度稍微冷卻后，趁熱倒平板，待冷卻凝固后使用無菌打孔器將瓊脂板做打孔處理[10]，并用封口膜將平板封口后放4 ℃條件下保存，以備后續(xù)藥敏試驗使用。

1.2.2 茶樹油原液稀釋 將茶樹油原液連續(xù)采用倍比稀釋法（二倍比）處理，最終形成的茶樹油溶液分別相當(dāng)于茶樹油原液濃度×20、原液濃度×2-1、原液濃度×2-2、原液濃度×2-3、原液濃度×2-4、原液濃度×2-5、原液濃度×2-6、原液濃度×2-7、原液濃度×2-8、原液濃度×2-9。

1.2.3 供試菌菌懸液的制備 在液體培養(yǎng)基中取適量菌種溶液放于恒溫?fù)u床培養(yǎng)12～20 h，將所得菌液采用平板劃線法進(jìn)行菌種的純化分離培養(yǎng)[11]，恒溫培養(yǎng)24 h后取出，用高壓蒸汽滅菌處理過的無菌接種環(huán)分別挑取長勢良好的供試菌單個菌落，分別接種于1.2.1制備的無菌瓊脂液體培養(yǎng)基，放于37 ℃恒溫?fù)u床孵育24 h。24 h后，將所得供試菌菌懸液取0.1 ml，采用倍比稀釋法連續(xù)進(jìn)行8次十倍比梯度稀釋處理，將稀釋后的菌懸液分別進(jìn)行平板涂布，并放于恒溫培養(yǎng)箱恒溫孵育過夜，之后采用平板計數(shù)法計數(shù)每個稀釋梯度平板的供試菌數(shù)，計算不同稀釋度的供試菌菌懸液濃度。最終經(jīng)稀釋得到濃度為1.5×108cfu/ml的3種供試菌菌懸液，4 ℃保存，以備后續(xù)藥敏試驗使用。

1.2.4 藥敏試驗 試驗前將瓊脂板放至37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h，以檢測瓊脂板是否有雜菌污染。選用無污染的滅菌瓊脂板，采用平板涂布法將菌懸液均勻涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，然后將茶樹油原液100 μl加入到提前打好的孔內(nèi)[10]，隨后將其置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，之后測定抑菌圈大小，并判斷茶樹油對3種供試菌的抑菌敏感度。

1.2.5 茶樹精油的最低抑菌濃度（MIC）測定采用微量肉湯稀釋法測定MIC[12]：將不同稀釋濃度的茶樹油溶液分別加至滅菌過的96孔板中，第2～11孔加不同濃度的茶樹油稀釋溶液，每孔20 μl，再每孔加菌懸液180 μl。第1孔加20 μl無菌水和180 μl液體培養(yǎng)基作空白對照；第12孔加20 μl無菌水和180 μl菌懸液作陽性對照，密封后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24 h后，測定OD600處的吸光度，重復(fù)3次并判斷結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹油抑菌活性

抗生素抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)[13]：最敏感級抑菌圈直徑大于15 mm，中度敏感抑菌圈直徑為10～15 mm，低度敏感抑菌圈直徑為7～9 mm，不敏感無抑菌圈。測量結(jié)果表明（表1），在3種菌中，茶樹油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性為最敏感，對沙門氏菌、大腸桿菌均為中度敏感。

表1 茶樹油對供試菌的抑菌直徑

2.2 茶樹油最小抑菌濃度

橫坐標(biāo)為茶樹油原液稀釋倍數(shù)，縱坐標(biāo)為OD600吸光度值，其最大突變區(qū)間即為茶樹油MIC濃度區(qū)間。結(jié)果表明，茶樹油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌抑制的突變區(qū)間分別主要發(fā)生在茶樹油原液稀釋倍數(shù)為2-3×10-1～2-2×10-1（圖1）、2-4×10-1～2-3×10-1（圖2）、2-7×10-1～2-6×10-1（圖3）區(qū)間內(nèi)。

圖1 金黃色葡萄球菌抑菌活性

圖2 沙門氏菌抑菌活性

圖3 大腸桿菌抑菌活性

3 結(jié)論

在選用的3種細(xì)菌中，茶樹油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性為最敏感，對沙門氏菌和大腸桿菌的抑菌敏感度為中度敏感。作用于金黃色葡萄球菌和沙門氏菌時，需使用高濃度茶樹油；但茶樹油在較低濃度時對大腸桿菌仍然有較好的抑制效果，因此作用于大腸桿菌時使用低濃度茶樹油即可。在抗微生物制劑方面可以考慮采用茶樹油作為原料或者添加劑來進(jìn)行制備。