沉默miR-208a對急性心肌梗死大鼠心室重構(gòu)的影響及機制研究

劉國星 杜見霞 劉秀紅 杜亞軍 但國梅 王浩 董振松

急性心肌梗死是一種由冠狀動脈急性、持續(xù)性供血、供氧不足而導(dǎo)致的心肌組織細(xì)胞壞死癥狀[1,2]。急性心肌梗死患者主要臨床表現(xiàn)為胸骨后持久、劇烈疼痛，對患者生活質(zhì)量、身體健康造成嚴(yán)重的威脅[3,4]。據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，老年人為急性心肌梗死的高發(fā)群體，近年來我國人口老齡化現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重，急性心肌梗死新增病例連年上升[5,6]。目前臨床醫(yī)學(xué)尚無特效的針對急性心肌梗死的藥物、治療手段，急性心肌梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展對患者生命安全造成嚴(yán)重威脅，因此探究急性心肌梗死發(fā)病機制，尋找新的治療靶點，對急性心肌梗死的治療具有重要意義。本研究建立急性心肌梗死大鼠模型，靶向調(diào)控miR-208a表達(dá)，報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供，年齡9～10個月，平均(9.5±0.4)個月；體重219～232 g，平均體重(226.1±5.2)g。在相對濕度45%～55%、溫度(24.1±2.2)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周，光照12 h/d。本研究醫(yī)我院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：兔抗大鼠miR-208a抗體(Hyclone公司)；兔抗小鼠Bcl-2抗體(Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠Caspase-3、TGF-β1抗體(Gibco公司)；小鼠抗大鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)抗體(BD公司)；小鼠抗兔過氧化脂質(zhì)(LPO)、丙二醛(MDA)抗體(Sigma公司)；大鼠抗小鼠Smad2、Smad3抗體(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組:隨機選取10只大鼠作為正常組，不做任何處理。其余30只大鼠建立急性心肌梗死模型：麻醉干預(yù)后，使用剪刀將左側(cè)第3、4段肋間皮膚剪開，打開大鼠胸腔，使大鼠心臟組織暴露于術(shù)野之中。剪開心包膜后對冠狀動脈前支進(jìn)行穿線結(jié)扎，之后清創(chuàng)縫合。對所有大鼠進(jìn)行心電圖檢查，ST段上抬至弓背向上為建模成功。最終建模成功25只，將25只急性心肌梗死大鼠隨機分為沉默miR-208a組(n=9)以及模型組(n=8)、過表達(dá)miR-208a組(n=8)。過表達(dá)miR-208a組大鼠尾部靜脈注射30 mg/kg agomiR-208a，沉默miR-208a組大鼠尾部靜脈注射30mg/kg antagomiR-208a，正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 心功能檢測:對大鼠麻醉處理后，左傾30°仰臥固定，剃毛后將超聲探頭置于左胸骨，與中線夾角20°，觀察記錄4組大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)水平。

1.2.3 標(biāo)本制備:取4組大鼠尾部靜脈血2 ml,2 000 r/min離心處理15 min后分離上清液，在-80℃環(huán)境中保存待檢。對各組大鼠進(jìn)行麻醉處理后，斷頭法處死，取大鼠心臟，清洗后觀察外觀，之后固定在4%甲醛中，完全浸泡，于24 h后行常規(guī)石蠟包埋及連續(xù)切片。

1.2.4 HE染色:首先將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的乙醇中各復(fù)水3 min。使用蘇木精染色15 min后清洗3次，使用鹽酸乙醇分化處理30 s，充分清洗之后使用1%伊紅染色，使用乙醇進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后使用顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡情況檢測:在1% TTC溶液中孵育大鼠心肌組織切片20 min(孵育環(huán)境：避光，溫度保持在37℃),使用BI-2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)計算大鼠心肌梗死面積。使用TUNEL法檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況，計算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，并進(jìn)行組間比較。

1.2.6 miR-146a表達(dá)檢測:RT-PCR檢測miR-146a表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得cDNA，設(shè)計引物序列，采用2-△△Ct方法計算miR-146a表達(dá)。

1.2.7 B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、果蠅MAD類似基因2(Smad2)、果蠅MAD類似基因3(Smad3)相對表達(dá)量檢測:蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3的表達(dá)：取150℃的Ripa裂解液,1.5℃ PMSF冰中孵育30 min,4℃ 1 500 r/min離心15 min，取上清。每個樣品取15 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入PDVF膜，5%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對Bcl-2、Caspase-3、TGF-β1、Smad2、Smad3相對表達(dá)量行檢測。

1.2.8 免疫透射比濁法檢測GSH-Px、LPO、MDA水平:準(zhǔn)備3個試管，記為標(biāo)準(zhǔn)管、測定管、空白管，均添加緩沖液350 μl，標(biāo)準(zhǔn)管加入20 μl GSH-Px、LPO、MDA標(biāo)準(zhǔn)液，測定管中加入20 μl血清，空白管中加入20 μl蒸餾水3個試管分別搖晃均勻，常溫環(huán)境靜置5～10 min后使用分光光度計進(jìn)行比色，在500 nm波長處以空白管調(diào)零，記錄吸光度，計算血清GSH-Px、LPO、MDA水平。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠心臟外觀、心肌組織病理學(xué)觀察情況 正常組大鼠心臟外觀顏色較為紅潤，形態(tài)正常，病理切片中心肌組織細(xì)胞排列規(guī)則且緊密；模型組、過表達(dá)miR-208a組大鼠心室腔變大，且出現(xiàn)大面積的梗死區(qū)域，心肌組織細(xì)胞排列雜亂，出現(xiàn)較多膠原纖維；沉默miR-208a組大鼠心室腔擴大現(xiàn)象出現(xiàn)緩解，梗死區(qū)域明顯縮小，心肌組織細(xì)胞排列較為雜亂，炎性細(xì)胞減少。見圖1、2。

圖1 4組大鼠心臟外觀情況

圖2 4組大鼠心肌組織病理學(xué)圖片(HE×200)

2.2 4組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)比較 與正常組比較，模型組、過表達(dá)miR-208a組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)較高，且過表達(dá)miR-208a組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、過表達(dá)miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 4組大鼠miR-208a、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)比較

圖3 Bcl-2、Caspase-3表達(dá)Western blot圖；A 正常組；B 模型組；C 過表達(dá)miR-208a組；D 沉默miR-208a組

2.3 4組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平比較 與正常組比較，模型組、過表達(dá)miR-208a組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平較高，且過表達(dá)miR-208a組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、過表達(dá)miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平比較

2.4 4組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 與正常組比較，模型組、過表達(dá)miR-208a組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較高，且過表達(dá)miR-208a組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、過表達(dá)miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠心肌梗死面積、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.5 4組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較 與正常組大鼠相比，模型組、過表達(dá)miR-208a組大鼠GSH-Px水平較低，LPO、MDA水平較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、過表達(dá)miR-208a組相比，沉默miR-208a組大鼠GSH-Px水平較高，LPO、MDA水平較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠GSH-Px、LPO、MDA水平比較

2.6 4組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)比較 與正常組比較，模型組、過表達(dá)miR-208a組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)較高，且過表達(dá)miR-208a組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)高于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組、過表達(dá)miR-208a組比較，沉默miR-208a組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖4。

表5 4組大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)比較

圖4 TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)Western blot圖;A 正常組；B 模型組；C 過表達(dá)miR-208a組；D 沉默miR-208a組

3 討論

急性心肌梗死為一種臨床較為常見的心內(nèi)科疾病，會導(dǎo)致機體心肌組織壞死，嚴(yán)重威脅患者身體健康[7,8]。目前臨床較為常用的治療急性心肌梗死的手段包括藥物治療、介入治療、溶栓治療等，但是臨床療效并不理想，因此許多專家學(xué)者開始致力于急性心肌梗死臨床治療的研究[9,10]。目前為止，臨床醫(yī)學(xué)尚未將急性心肌梗死的發(fā)病機制研究透徹，許多專家學(xué)者通過分子生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)等途徑對急性心肌梗死發(fā)病機制進(jìn)行研究[11,12]。微小RNA(miRNA)在大多數(shù)生物中大量存在，miRNA與機體炎性反應(yīng)、免疫狀態(tài)、微生物感染等多種病理學(xué)變化具有密切聯(lián)系。大量研究表明，miRNA的異常表達(dá)與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，miR-208a為miRNA家族的組成成員，在急性心肌梗死中表達(dá)出現(xiàn)明顯異常，但是關(guān)于調(diào)控miR-208a表達(dá)對急性心肌梗死干預(yù)效果的研究還鮮有報道[13,14]。

有研究表明，miR-208a作為miRNA家族的重要成員，在機體心臟組織病變中具有一定的特異性[15]。Bcl-2是線粒體細(xì)胞凋亡通路中的重要基因，其表達(dá)的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[16]。Caspase-3作為caspase家族重要成員，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[17]。有學(xué)者在研究中表示，急性心肌梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展與心肌組織細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Bcl-2、Caspase-3的異常表達(dá)在其中發(fā)揮重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，與正常大鼠比較，急性心肌梗死大鼠miR-208a表達(dá)較高，說明miR-208a在急性心肌梗死中呈現(xiàn)異常高表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死大鼠Bcl-2、Caspase-3表達(dá)較高，沉默miR-208a表達(dá)的大鼠miR-208a表達(dá)下調(diào)，同時Bcl-2、Caspase-3表達(dá)表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，出現(xiàn)這一研究結(jié)果的原因可能是沉默miR-208a表達(dá)能夠靶向調(diào)控Bcl-2、Caspase-3表達(dá)，從而起到抑制急性心肌梗死大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡的作用。

急性心肌梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展會導(dǎo)致心室重構(gòu)，對機體心功能造成嚴(yán)重的影響[18,19]。LVEDd、LVEDV、LVESd是常用的評價機體心功能的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性心肌梗死大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平異常上升，說明急性心肌梗死大鼠伴隨著心室重構(gòu)狀況，沉默miR-208a表達(dá)的大鼠LVEDd、LVEDV、LVESd水平出現(xiàn)明顯的下降，說明沉默miR-208a表達(dá)能夠調(diào)控LVEDd、LVEDV、LVESd水平，改善大鼠心室重構(gòu)狀況，對大鼠心功能的改善具有積極作用。

急性心肌梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著機體心肌組織氧化應(yīng)激損傷[20,21]。減輕機體心肌組織氧化應(yīng)激損傷對急性心肌梗死患者的臨床治療、預(yù)后改善具有重要意義。GSH-Px、LPO、MDA水平變化情況與機體抗氧化防御系統(tǒng)的失衡、氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，相比正常大鼠，急性心肌梗死大鼠GSH-Px水平較低，LPO、MDA水平較高，說明急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展伴隨著氧化應(yīng)激損傷；沉默miR-208a表達(dá)的大鼠GSH-Px水平上調(diào)，LPO、MDA水平下調(diào)，說明沉默miR-208a表達(dá)，能夠提升急性心肌梗死大鼠抗氧化能力，減輕氧化應(yīng)激損傷，從而發(fā)揮干預(yù)效果。

急性心肌梗死的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著心肌纖維化，心肌纖維化嚴(yán)重程度與急性心肌梗死嚴(yán)重程度以及患者預(yù)后密切相關(guān)[22-24]。TGF-β/Smads信號通路相關(guān)蛋白與心肌纖維化關(guān)系密切。本研究結(jié)果顯示，急性心肌梗死大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)較高，沉默miR-208a表達(dá)后，急性心肌梗死大鼠TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，說明沉默miR-208a表達(dá)能夠調(diào)控TGF-β/Smads通路蛋白，減輕急性心肌梗死大鼠心肌纖維化，從而起到心肌保護(hù)作用。

綜上所述，沉默急性心肌梗死大鼠miR-208a表達(dá)，能夠靶向調(diào)控Bcl-2、Caspase-3表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心室重構(gòu)，能夠減輕心肌組織氧化應(yīng)激損傷以及心肌纖維化，為急性心肌梗死的臨床治療提供一定的參考依據(jù)。