氯胺酮麻醉對大鼠認知功能的影響及作用機制

李峰 甘建輝 董文岳 王藝 劉鋒 李永強

術后認知障礙是臨床上常見的并發癥之一，嚴重影響患者的生存質量，研究表明術后并發癥與麻醉藥品的使用、引發神經功能的損傷有關[1,2]。老年人群神經系統較為脆弱，嬰幼兒神經系統較為敏感，均為術后認知功能的易發人群[3]。氯胺酮是臨床上常見的靜脈麻醉類藥物，具有良好的鎮靜、麻醉效果，但對神經系統可能造成一定的損傷，對認知功能造成一定的損傷，使用方面存在一定的爭議[4,5]。目前對于麻醉藥對中樞神經系統的作用機制尚不明確，目前主要認為的機制為細胞啟動自殺式程序，改變神經遞質傳到，引發神經細胞凋亡有關等[6,7]。為進一步探討氯胺酮對大鼠認知功能的影響及其作用機制，本實驗以40只大鼠為研究對象，主要通過Morris 水迷宮、TUNEL法考察氯胺酮對認知功能的影響，并對其機制進行研究，進而為臨床麻醉合理用藥提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取鼠齡1周的健康大鼠40只(SPF級雄性，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，生產許可證號：SCXK2019-0008)，體重約為15 g，由山東動物實驗動物研究中心提供，均通過了認知功能及運動功能測試，將大鼠至于自然晝夜光照，溫度25℃，濕度40.0%～50.0%條件下飼養1周，消除周圍環境影響，將大鼠隨機分為A、B、C、D組，每組10只。A組為對照組，注射同等劑量的等滲0.9%氯化鈉溶液，B組注射50 mg/kg的氯胺酮，C組注射75 mg/kg的氯胺酮，D組注射100 mg/kg的氯胺酮[8]，以后每小時追加一半的劑量進行麻醉維持，所有操作符合動物倫理學會要求，善待動物，降低對動物的傷害。大鼠的鼻唇、趾端膚色保持紅潤，4組體重、呼吸頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 4組大鼠的基本信息

1.2 方法

1.2.1 水迷宮實驗：以高0.5 m、寬1.2 m的水池建立水迷宮，按順時針方向分為4個象限，將水池及平臺及水均染成黑色，平臺固定于第3象限水下1 cm處，水溫控制為25℃左右，麻醉前1 d使大鼠置于水迷宮中試游5 min，以適應周圍環境，氯胺酮麻醉后的10 h進行定位航行實驗，歷時5 d，分別記錄為D1～D5，每天上下午各訓練2次，將大鼠面向池壁從不同象限滑入水池，記錄大鼠尋找到平臺的時間，若2 min內未找到平臺，則對大鼠進行指引，于平臺處休息20 s，進行下一輪的訓練。第6天進行空間探索實驗，撤去平臺，選一任意點作為入水點，記錄2 min內大鼠在平臺所在象限的停留時間，整個實驗過程中，保持整體環境一致，以排除外界干擾。

1.2.2 海馬區神經細胞元凋亡測定：采用TUNEL法進行神經元凋亡的測定，主要通過試劑盒進行測定，使用并與標準圖像及逆行對比分析，以細胞核中出現黃色顆粒為判斷標準。

1.2.3 Fas蛋白測定：使用試劑盒對Fas蛋白含量進行測定，嚴格按照說明及逆行操作，以海馬神經元細胞是否出現黃色作為判斷依據，使用圖像分析儀進行觀測。

2 結果

2.1 水迷宮測試 對4組大鼠進行了水迷宮測試，進而對大鼠的空間學習能力及空間記憶能力及逆行考察。對小鼠的運動軌跡進行研究分析。見圖1。

2.1.1 空間學習能力：本次實驗通過定位航行實驗對大鼠的空間學習能力進行了考察。4組小鼠逃逸時間均隨著時間的延長而縮短，C、D組大鼠的逃逸時間均明顯長于A組(P<0.05)；B組與A組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，B、C、D組間差異有統計學意義(P<0.05)。中、高劑量的氯胺酮會對大鼠學習能力造成一定的影響。見表2，圖2。

表2 4組大鼠的逃逸時間比較

2.1.2 空間探索能力：本次實驗通過空間探索實驗，對大鼠的空間探索能力進行了考察。A、B、C、D組在原平臺象限停留時間依次減少，差異有統計學意義(P<0.05)。氯胺酮對大鼠的空間探索能力具有一定的影響，且與劑量呈依賴關系，劑量越大，對大鼠空間探索能力的損傷越大。見表3。

2.2 海馬區神經元凋亡 對4組大鼠海馬區神經元的凋亡情況，進行研究分析。A、B、C、D組神經元凋亡率依次增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

圖2 4組大鼠的逃逸時間比較

表3 4組小鼠的平臺所在象限停留時間

表4 4組大鼠的神經元凋亡情況

2.3 Fas蛋白表達 對4組大鼠的Fas蛋白表達情況進行研究分析。A、B、C、D組Fas蛋白表達量依次增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表5。

表5 4組大鼠Fas蛋白表達情況

3 討論

氯胺酮是常見的一種鎮靜麻醉藥，已被普遍運用于內外科手術治療之中，具有良好的鎮靜、麻醉效果，但容易對神經系統造成一定的傷害，對記憶及認知造成一定的影響[8,9]。氯胺酮對神經功能的傷害尚不明確，可能與氯胺酮在一定程度上會引起神經元細胞的凋亡有關，進而影響大鼠的認知功能。氯胺酮的神經功能損傷副作用成為阻礙該類藥品應用的重要原因，是麻醉科急需解決的問題之一[10]。在對大鼠的認知及學習能力研究中，主要采用經典的Morris水迷宮實驗，通過測定逃避潛伏期，測定大鼠的認知及記憶保持能力。本次研究中，氯胺酮注射劑量越少，潛逃時間越短，說明氯胺酮對大鼠的認知功能造成一定影響，且濃度越高影響越大。Schumacher等[11]對氯胺酮對大鼠認知功能的影響進行了分析研究，結果表明氯胺酮會對大鼠的認知功能造成一定的損害，且與劑量密切相關，劑量越大，所造成的損傷往往越嚴重。李桂婷等[12]對氯胺酮對幼年小鼠空間學習記憶功能進行了研究分析，將小鼠隨機分為了對照組及氯胺酮組，結果表明氯胺酮組小鼠的學習記憶功能衰退，小鼠的神經元存在一定的損傷。黃丹等[13]對氯胺酮在老齡大鼠認知功能損傷的作用與機制進行了研究分析，將42只大鼠分為不同的組別，給予不同劑量的氯胺酮進行研究分析，結果表明氯胺酮會損傷大鼠的認知功能，且呈濃度依賴性。以上研究均提示氯胺酮會對大鼠的認知功能造成一定的損傷且與劑量密切相關，在氯胺酮的使用中應嚴格把控用藥劑量，在保證治療效果的前體下盡量減少用藥，進而降低對認知功能的損傷。

Fas蛋白又稱為細胞表面蛋白，主要參與細胞的凋亡過程。研究表明，Fas蛋白所介導的細胞凋亡是海馬神經元損傷的重要機制之一，往往神經元損傷較為嚴重的部位，該蛋白表達含量較高[14]。氯胺酮不僅會對大鼠認知功能造成一定的影響，影響海馬區域相關蛋白的表達[15]。馬飛等[16]對腦損傷大鼠Fas的含量水平進行了研究分析，結果表明Fas蛋白表達水平與神經元的損傷密切相關，神經損傷越嚴重，Fas表達水平往往越高。曹進麗[17]對Fas與神經元細胞凋亡間的聯系進行了研究分析，結果表明Fas的過量表達是促進神經元細胞凋亡重要原因之一。在本次研究中對大鼠Fas蛋白表達情況進行研究分析，注射氯胺酮后，大鼠的Fas蛋白表達水平明顯升高。Fas蛋白升高可能是神經元受損，進而影響認知功能的重要原因[18-23]。

綜上可知，氯胺酮對大鼠的認知功能具有一定的損傷作用，這可能與海馬區的Fas蛋白分泌增高，促進神經元細胞凋亡有關[24-27]，在今后氯胺酮的使用過程中，應嚴格控制使用劑量，降低對認知功能的影響。