CLCF1在腎移植功能恢復(fù)延遲中的表達(dá)變化

仇煒 王思旭 胡新一 田野 蘇明

移植腎功能恢復(fù)延遲(delayed graft function,DGF)是腎移植術(shù)后常見的并發(fā)癥，其危害較大，并導(dǎo)致患者住院時(shí)間延長(zhǎng)以及醫(yī)療費(fèi)用的增加，更為嚴(yán)重的是DGF可顯著縮短移植腎的存活期，嚴(yán)重降低腎移植效果。DGF發(fā)病原因目前尚不明確，可能與缺血/再灌注損傷有關(guān)[1,2]。因此，發(fā)現(xiàn)新的DGF相關(guān)因子對(duì)于DGF的診斷和治療有重要意義。心肌營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1，CLCF1)屬于白介素-6(interleukin-6，IL-6)家族成員，是一種分泌型細(xì)胞因子。該因子與細(xì)胞因子受體樣因子1(cytokine receptor-like factor 1，CRLF1)或可溶性睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(soluble ciliary neurotrophic factor receptor，sCNTFR)相結(jié)合，并形成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物激活STAT3信號(hào)通路[3,4]。有研究在DGF中進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)CLCF1可能在DGF腎組織中表達(dá)上調(diào)。然而，CLCF1與DGF之間的關(guān)系尚不明確。本研究在腎移植術(shù)后并發(fā)DGF的患者中通過研究CLCF1的表達(dá)變化，分析該因子與DGF之間的關(guān)系，旨在為腎移植術(shù)后DGF的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者均來自于2016年1月至2019年1月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院泌尿外科行腎移植手術(shù)的受者，均于術(shù)后24 h內(nèi)采集靜脈血，立刻在3 000 r/min條件下離心5 min，分離血漿凍存于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｐg(shù)后每日監(jiān)測(cè)血清肌酐變化。腎移植術(shù)后血清肌酐無顯著改善者為DGF組(n=10)。即刻移植腎功能恢復(fù)(immediate graft function，IGF)患者為IGF組(n=15)。2組患者年齡、性別比、體重，高血壓、糖尿病發(fā)病率，2組供者年齡、性別比、冷缺血時(shí)間、受者移植前血肌酐水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 采用雙抗體夾心法人酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Cusabio，武漢)測(cè)定血漿中CLCF1表達(dá)。操作方法按照試劑商的說明進(jìn)行。簡(jiǎn)言之，將血漿樣品加到抗CLCF1抗體預(yù)包被的96孔板上，并在37℃下培養(yǎng)2 h。隨后棄去上清，加入生物素結(jié)合抗體替換上清液并在37℃下孵育1 h。隨后漂洗孔板，加入HRP標(biāo)記的親和素，在37℃下孵育1 h。漂洗孔板5次后，加入TMB底物，并在37℃下反應(yīng)1 h，然后加入終止液終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算CLCF1水平。

表1 2組基線資料比較

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)采用中位數(shù)(四分位距)表示。采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析2組間的差異。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組患者血清肌酐水平變化比較 DGF組患者血清肌酐無下降趨勢(shì)，而IGF患者血肌酐水平有較大降幅。見表2，圖1。

表2 2組腎移植受者術(shù)前及術(shù)后血清肌酐動(dòng)態(tài)變化比較

圖1 IGF和DGF腎移植受者血肌酐變化表

2.2 2組血漿CLCF1表達(dá)水平在腎移植患者中上調(diào) 我們檢測(cè)了移植后24 h內(nèi)所有腎移植受者血清CLCF1的變化。與IGF受者相比，DGF受者的血漿CLCF1顯著增加(2.53 ng/ml vs 1.01 ng/ml)。提示CLCF1與腎移植DGF有關(guān)。見圖2，表3。

2.3 血漿CLCF1水平與腎移植患者血肌酐下降水平之間的關(guān)系 術(shù)后第1到第5天血漿CLCF1水平與血肌酐下降值之間的關(guān)系，血肌酐負(fù)值越大提示腎功能恢復(fù)越好。結(jié)果可見，在術(shù)后第2、4、5天，血肌酐下

圖2 血漿CLCF1表達(dá)水平與腎移植DGF之間的關(guān)系

表3 25例腎移植受者術(shù)后24 h內(nèi)血漿CLCF1水平比較 ng/ml,M(P25，P75)

降值(ΔCr)與CLCF1呈正相關(guān)(r值分別為0.444、0.447和0.639，P<0.05)，即CLCF1越大血肌酐下降幅度越小，腎功能恢復(fù)越差。由此提示，CLCF1是腎移植術(shù)后腎功能恢復(fù)的標(biāo)志性分子。見圖3。

圖3 血漿CLCF1水平與血肌酐變化的相關(guān)性；縱軸為腎移植術(shù)后第1到第5天血肌酐與術(shù)前血肌酐的差值(單位：μmol/L)，橫軸為血漿CLCF1濃度，采用Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)ρ及P值如圖所示

3 討論

腎移植是終末期腎病最為有效的治療方法之一。我國(guó)每年等待腎移植治療的患者群體很大，而腎源相對(duì)不足的情況下導(dǎo)致了現(xiàn)階段的供需矛盾。供腎標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)大化是解決當(dāng)前供需矛盾的有效策略。因此，維持移植腎的生存期對(duì)于節(jié)省醫(yī)療資料開支有至關(guān)重要的作用。但是由于多種原因，部分患者術(shù)后會(huì)產(chǎn)生DGF，嚴(yán)重影響腎移植治療效果。因此，找到與腎移植DGF相關(guān)的因子，對(duì)于該病的防治有至關(guān)重要的意義。本研究發(fā)現(xiàn)，CLCF1是一個(gè)新的DGF相關(guān)分子，其表達(dá)在DGF患者血漿中呈上調(diào)趨勢(shì)，這可能為腎移植術(shù)后DGF的防治提供有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

DGF的發(fā)生可能與多種危險(xiǎn)因素有關(guān)。其中，缺血再灌注損傷是可直接導(dǎo)致DGF的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。缺血再灌注損傷時(shí)可導(dǎo)致組織器官供氧不足，并通過促進(jìn)糖酵解作用而引起細(xì)胞酸中毒[5]。缺血再灌注損傷還可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并加重炎癥和氧化損傷[6]，而由于局部聚集的白細(xì)胞可黏附在微血管內(nèi)，引起炎性反應(yīng)[7]。這些變化增強(qiáng)了活性氧的釋放，從而促進(jìn)炎性介質(zhì)和蛋白水解酶的產(chǎn)生[8]，并最終導(dǎo)致DGF。

CLCF1是IL-6家族成員，廣泛表達(dá)于淋巴結(jié)、脾臟等次級(jí)淋巴器官及骨髓、卵巢、胎盤、腎臟、垂體等多種器官。CLCF1的分泌需要與CRLF1或sCNTFR相互作用以異源二聚體形式釋放[9]，并與細(xì)胞表面CNTFR結(jié)合，進(jìn)而激活STAT3和ERK1/2/MAPK通路[9]。多種促炎因子，如TNF-α、INF-γ和IL-6等均可上調(diào)CRLF表達(dá)，并增強(qiáng)CLCF1的作用[10]。人類CLCF1或CRLF1基因突變導(dǎo)致CISS，而小鼠CLCF1的缺失則無法成活[11]。最近研究表明，CLCF1參與間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[21]以及巨噬細(xì)胞-泡沫細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[12]。而在腎移植中，CLCF1可觸發(fā)腎移植后局灶節(jié)段性腎小球硬化的復(fù)發(fā)[13]。在本研究中，我們觀察到DGF腎移植受者的血漿CLCF1水平顯著上調(diào)，提示CLCF1可能在腎移植術(shù)后DGF中有重要作用，而該分子對(duì)腎移植DGF的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，CLCF1是腎移植術(shù)后DGF中上調(diào)表達(dá)的分子，可能在腎移植DGF診斷及治療過程中有重要意義。