miR-149-5p過表達(dá)對(duì)重癥肺炎大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路的影響研究

蔣渝 張亮宇 黃薇

重癥肺炎在臨床上是常見的疾病之一，是指肺部的炎癥情況比較嚴(yán)重，可引起全身炎性反應(yīng)，如果肺炎患者出現(xiàn)嚴(yán)重的低氧血癥或急性呼吸衰竭則需要通氣支持；或出現(xiàn)低血壓、休克等循環(huán)衰竭表現(xiàn)和其他器官功能障礙可認(rèn)定為重癥肺炎[1,2]。常見的病因是在伴有心肺基礎(chǔ)或附加危險(xiǎn)因素上感染肺炎，特殊病原微生物(SARS病毒、禽流感病毒、軍團(tuán)菌等)感染，會(huì)增加肺炎的嚴(yán)重程度和死亡風(fēng)險(xiǎn)；臨床主要表現(xiàn)有嗜睡、煩躁、呼吸衰竭、精神萎靡、血壓下降等，重者會(huì)出現(xiàn)昏迷、驚厥、意識(shí)障礙、視盤水腫，進(jìn)而出現(xiàn)腦疝[3]。臨床常用的治療手段為藥物治療，其中主要環(huán)節(jié)為抗感染治療，抗生素和給藥途徑則需參考患者的年齡、吸入史、有無基礎(chǔ)疾病、肺炎的嚴(yán)重程度等[4]。重癥肺炎的原則在于重視病原學(xué)診斷和早采集呼吸道標(biāo)本，查找病原體的方式有采用血培養(yǎng)、血清檢測(cè)等途徑[5]。在本研究中，主要分析miR-149-5p過表達(dá)對(duì)重癥肺炎大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選取45只清潔級(jí)、SPF級(jí)小鼠，雄雌各半，由希百壽藥業(yè)有限公司提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(豫)2020-0001]，鼠齡3～6個(gè)月，平均鼠齡(4.5±0.75)個(gè)月；體重214～258 g，平均體重(236±11)g；小鼠均在無病原菌的干凈籠子里喂養(yǎng)，所飲用的水和食物都要進(jìn)行過高溫以及高壓的消毒，飼養(yǎng)溫度維持在23℃。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 養(yǎng)血瓊脂糖平板(北京泰澤嘉業(yè)科技發(fā)展有限公司)；肺炎克雷伯菌(上海北諾生物科技有限公司)；酶聯(lián)免疫試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)；恒溫孵育箱(香港友誠生物科技有限公司)；胎牛血清(武漢普諾賽生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建模:隨機(jī)選取45只大鼠中15只作為對(duì)照組，其余大鼠參照吳萍等[6]研究實(shí)驗(yàn)中重癥肺炎模型建立方法建立重癥肺炎大鼠模型，模型構(gòu)建前1 d，在養(yǎng)血瓊脂糖平板上接種肺炎克雷伯菌并放置在37℃恒溫培養(yǎng)，次日將菌落收集后并用無菌0.9%氯化鈉溶液將其稀釋呈1.2×1014CFU/L的混懸液。在大鼠腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液用于麻醉，頸部備皮消毒，在無菌環(huán)境下切開頸部皮膚使上段氣管暴露，選用24G的Y型靜脈留置針經(jīng)氣管插管，將菌液從留置針白色帽端處注入大鼠體內(nèi)。將完全稀釋好的肺炎克雷伯菌混合液，對(duì)過表達(dá)組、沉默組大鼠進(jìn)行緩慢灌注，每只0.3 ml；為降低大鼠肺部刺激，每注射0.05 ml固定豎立左右轉(zhuǎn)動(dòng)45 s，對(duì)照組大鼠灌注等體積0.9%氯化鈉溶液。末次灌注結(jié)束后讓大鼠保持豎立和倒立各2 min，讓菌液均勻分布雙肺各肺葉，然后緩慢抽出靜脈留置針，將傷口縫合并進(jìn)行局部消毒。

1.3.2 肺組織病理組織學(xué)觀察評(píng)價(jià):選取適當(dāng)體積的肺組織，經(jīng)多聚甲醛固定后或石蠟保存，做成組織切片，HE染色后中性樹膠，蓋玻片封固，顯微鏡下觀察大鼠肺組織上皮細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:將大鼠肺組織細(xì)胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將其放置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，取生長(zhǎng)情況良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于6孔細(xì)胞板，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，可進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組、上調(diào)組和下調(diào)組，其中對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理，而對(duì)上調(diào)組、下調(diào)組按照吉?jiǎng)P基因《慢病毒載體使用操作手冊(cè)》分別進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)LV-control和LV-miR-145-5p。

1.3.4 3組大鼠肺組織凋亡蛋白表達(dá)量評(píng)價(jià):采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9水平，實(shí)驗(yàn)步驟如下：使用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組，染色結(jié)果采取半定量分析，高倍鏡下(×400)每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，采用同濟(jì)HMIAS-2000高清晰度彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)檢測(cè)吸光度值，計(jì)算平均值。

1.3.5 3組大鼠肺組織中炎性因子水平評(píng)價(jià):采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)大鼠炎性因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平，實(shí)驗(yàn)步驟：將血清樣本置于室溫后，取出試劑盒，標(biāo)記酶標(biāo)板，制作標(biāo)準(zhǔn)品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應(yīng)孔上依次加入稀釋好的待測(cè)血清及標(biāo)準(zhǔn)品100 μl/孔，放置37℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應(yīng)板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續(xù)清洗反應(yīng)板4次后，在反應(yīng)孔內(nèi)加入TMB溶液100 μl/孔，置于37℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液100 μl/孔以終止反應(yīng)，在450 nm波長(zhǎng)(參考波長(zhǎng)570～630 nm)測(cè)定吸光度，顏色反應(yīng)深淺與IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平成正比，經(jīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10水平。

1.3.6 3組大鼠肺組織GSH、ROS及T-AOC含量評(píng)價(jià):采用MTT比色法檢測(cè)GSH、ROS及T-AOC含量，實(shí)驗(yàn)步驟：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，細(xì)胞按7×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔體積200 μl，培養(yǎng)2～4 d后，每孔加入MTT繼續(xù)孵育4 h后停止，棄上清液，懸浮細(xì)胞上的培養(yǎng)清液離心后再吸棄，每孔加入150 μl DMSO，振蕩12 min，選擇570 nm波長(zhǎng)，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值。

1.3.7 3組大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路因子表達(dá)量評(píng)價(jià):采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定3組細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路因子表達(dá)量,cDNA合成反轉(zhuǎn)錄體積20 μl，其中4 μl 總RNA，1 μl(0.5 μg)隨機(jī)引物、0.5 μl(20 U)RNase、2 μl 10 mMdNTP、0.8 μl(15 U)M-mlV反轉(zhuǎn)錄10×RT緩沖液3 μl，加滅菌DDW至20 μl，42℃水浴1 h，95℃ 5 min滅活M-mlV逆轉(zhuǎn)錄，-30℃凍存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)體積20 μl,其中2 μl 10×Buffer，2 μl MgCl2，2 μl dNTP，2 μl cDNA，2 μl引物，2.5U Taq DNA多聚酶，滅菌DDW加至20 μl。PCR反應(yīng)條件：經(jīng)95℃預(yù)變性10 min；95℃，15 s；60℃，30 s；循環(huán)40次。采用2-△△Ct方法計(jì)算出細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR通路因子Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量。見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理組織學(xué)觀察 對(duì)照組大鼠肺組織上皮完整，無損傷現(xiàn)象；沉默組大鼠肺組織明顯存在炎性因子浸潤(rùn)現(xiàn)象，平滑肌面積及厚度增加，還存在氣道上皮組織壞死、脫落，支氣管及其周邊組織結(jié)構(gòu)混亂，可見其肺損傷程度極其嚴(yán)重；過表達(dá)組大鼠肺組織狀態(tài)較沉默組有顯著改善，支氣管及其周邊組織趨于規(guī)整，且炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度降低，平滑肌面積及厚度增厚現(xiàn)象有所改善。見圖1。

2.2 3組大鼠肺組織凋亡蛋白表達(dá)量比較 過表達(dá)組、沉默組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組，過表達(dá)組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)量低于沉默組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 3組大鼠肺組織中炎性因子水平比較 過表達(dá)組、沉默組大鼠肺組織中炎性因子水平高于對(duì)照組(P<0.05)；過表達(dá)組大鼠肺組織中炎性因子水平低于沉默組(P<0.05)。見表3。

表2 3組大鼠肺組織凋亡蛋白表達(dá)量比較

表3 3組大鼠肺組織中炎性因子水平比較

2.4 3組大鼠肺組織GSH、ROS及T-AOC含量比較 過表達(dá)組、沉默組GSH、ROS高于對(duì)照組，T-AOC含量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；過表達(dá)組GSH、ROS低于沉默組，T-AOC含量高于沉默組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.5 3組大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路因子表達(dá)量比較 過表達(dá)組Bax mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，沉默組Bax mRNA表達(dá)量低于對(duì)照組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；過表達(dá)組Bax mRNA表達(dá)量高于沉默組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量低于沉默組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表4 3組大鼠肺組織GSH、ROS及T-AOC含量比較

表5 3組大鼠肺組織PI3K/Akt/mTOR通路因子表達(dá)量比較

3 討論

重癥肺炎是肺部感染性疾病之一，可引起機(jī)體多器官功能障礙，根據(jù)其獲得環(huán)境不同分為重癥社區(qū)獲得性肺炎和重癥醫(yī)院獲得性肺炎，兩種類型重癥肺炎均具有較高的患病率和死亡率[7,8]。目前對(duì)于重癥肺炎包括依賴抗菌藥物、機(jī)械通氣、液體支持和血液凈化等多手段，占用大量的醫(yī)療資源，但其病死率仍然較高，故找到其發(fā)病機(jī)制，對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸、獲得早期有效治療及改善預(yù)后都具有較為重要的意義價(jià)值[9]。miRNA是一類內(nèi)源性、序列高保守的單鏈非編碼小RNA，對(duì)基因表達(dá)具有調(diào)控作用[10]。有研究證實(shí)miR-149-5p在結(jié)腸癌、口腔鱗狀癌、肝癌、乳腺癌等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，其表達(dá)水平具有特異性[11]。在劉杰等[12]的研究中，miR-149-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞中呈過表達(dá)，可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，但在本文研究中過表達(dá)miR-149-5p可抑制細(xì)胞凋亡，減輕肺組織細(xì)胞的損傷程度，也證實(shí)miR-149-5p表達(dá)具有特異性。

Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶與真核細(xì)胞凋亡有密切關(guān)聯(lián)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡等過程中起調(diào)節(jié)作用[13]。Caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用，是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細(xì)胞殺傷機(jī)制的重要組成部分[14]。在曹麗萍等[15]的研究中，抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，可減少細(xì)胞凋亡，緩解大鼠肺組織損傷程度，與本文研究結(jié)果一致。Caspase-8在死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中扮演著重要的角色，是死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑中的重要分子，可通過寡聚而自身切割活化，可激活Caspase，產(chǎn)生凋亡效應(yīng)。Caspase-9與Caspase-8具有相似和不同影響了在Caspase家族起催化作用部位的聚合-裂解，能被用作具有高度選擇和合理性的Caspase抑制劑的活性區(qū)域具有差異性[16,17]。在本文研究中，過表達(dá)組大鼠Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9蛋白表達(dá)量低于沉默組，說明過表達(dá)miR-149-5p，可有效抑制Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達(dá)量，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，減輕肺組織的損傷程度。

PI3K/Akt/mTOR通路是經(jīng)典信號(hào)通路之一，主要通路因子有Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF等[18]。Bax和Bcl-2是Bcl-2基因家族中細(xì)胞凋亡的促進(jìn)基因，若Bax水平升高可拮抗Bcl-2的保護(hù)效應(yīng)而使細(xì)胞趨于死亡；Bcl-2是一種癌基因，具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡的作用，若Bcl-2過表達(dá)能增強(qiáng)所觀察細(xì)胞對(duì)大多數(shù)細(xì)胞毒素的抵抗性[19,20]。在劉月英等[21]的研究中，下調(diào)Bax、上調(diào)Bcl-2蛋白水平可降低細(xì)胞凋亡，與本文研究結(jié)果一致。pERK是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種Ⅰ型跨膜蛋白，屬于elF2a上游激酶家族中的一種；pERK信號(hào)通路的激活發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激早期，pERK通過誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本文研究中，過表達(dá)組Bax mRNA表達(dá)量高于沉默組，Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量低于沉默組，說明過表達(dá)miR-149-5p，可通過作用于PI3K/Akt/mTOR通路，調(diào)控Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，減輕機(jī)體炎性反應(yīng)和肺組織損傷。

綜上所述，過表達(dá)miR-149-5p，可通過作用于PI3K/Akt/mTOR通路，調(diào)控Bax、Bcl-2、BDNF、pERK、VGF mRNA表達(dá)量，減輕炎性反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡。但因本研究所采用的樣本數(shù)量有限和研究時(shí)間較短，為證實(shí)和對(duì)比miR-149-5p過表達(dá)對(duì)重癥肺炎大鼠肺組織PI3KAktmTOR通路的影響，還需進(jìn)一步開展大樣本試驗(yàn)證實(shí)。