RP-HPLC-ELSD同時測定滇女金丸中5個皂苷類成分的含量△

仲侃，張紫佳*，饒正云，馮寶文，王朝軍

1.上海中醫藥大學 中藥研究所，上海 201203；

2.紅云制藥（昆明）有限公司，云南 昆明 650033

滇女金丸是由熟三七、香附（醋）、炙黃芪、酒續斷等36 味中藥制成的丸劑，具有補腎止血、調經止帶的功效，臨床主要用于由腎虧血虛引起的月經不調、帶下量多、腰腿酸軟、小腹疼痛等。目前，滇女金丸的質量標準中僅以芍藥苷為含量測定指標成分。該方成分復雜多樣，單一指標難以有效控制制劑質量，因此，需對其質量控制方法進行提升。酒續斷在滇女金丸方中為君藥，熟三七、炙黃芪為臣藥。酒續斷具有補肝腎、止崩漏的功效，其中的川續斷皂苷Ⅵ含量較高，具有抗骨質疏松等作用[1-3]；三七能夠化瘀止血、活血定痛，熟三七中的皂苷類成分具有活血化瘀、通脈活絡的作用[4-8]；黃芪甲苷為黃芪的指標成分之一，在方中可起到補氣健脾、培土治水以治其本的功效[9-11]。由此可見，皂苷類成分為酒續斷、熟三七、炙黃芪三者的主要活性成分。為了更好地控制滇女金丸的質量，本實驗選擇三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ和黃芪甲苷為指標成分，建立了同時測定滇女金丸中這5 個成分含量的反相高效液相-蒸發光散射檢測法（RP-HPLC-ELSD）。該方法穩定可靠，為更好地提升滇女金丸的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260Ⅱ型系列高效液相色譜儀、1200 型系列高效液相色譜儀、色譜工作站（安捷倫科技有限公司）；BSA124S-CW 型電子天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］、KQ-250DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品三七皂苷R1（批號：110745-201619，純度：90.4%）、人參皂苷Rg1（批號：110703-201832，純度：94.0%）、人參皂苷Rb1（批號：110704-201625，純度：94.3%）、川續斷皂苷Ⅵ（批號：111685-201707，純度：94.3%）、黃芪甲苷（批號：110781-201492，純度：95.2%）均購于中國食品藥品檢定研究院；滇女金丸為市售（昆明生達制藥有限公司，批號：180609）；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

AgilentZORBAXSB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～20 min，20%A；20～30 min，20%～21%A；30～35 min，21%～31%A；35～50 min，31%A；50～58 min，31%～40%A）；流速為1 mL·min-1；柱溫為25 ℃；載氣為氮氣；體積流量為1.6 L·min-1；漂移管溫度為50 ℃；增益5.0；進樣量為10 μL；理論板數按三七皂苷R1峰計算應不低于7000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷10.92、12.77、13.87、30.64、11.47 mg 分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別制成質量濃度為1.092、1.277、1.387、3.064、1.147 mg·mL-1的對照品儲備液。取上述對照品儲備液適量，加甲醇制成質量濃度分別為三七皂苷R10.1 mg·mL-1，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb10.3 mg·mL-1，川續斷皂苷Ⅵ0.5 mg·mL-1，黃芪甲苷0.1 mg·mL-1的混合對照品溶液，供定量測定使用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取滇女金丸適量，研細，過三號篩，取約4.0 g，精密稱定，精密量取甲醇100 mL，冷浸過夜，超聲（750 W，40 kHz）提取2 h，放冷，濾過，濾液濃縮至干，少量多次加入水13 mL 溶解，水飽和正丁醇振搖萃取3 次，每次40 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性供試溶液的制備 按處方比例分別配制不含三七、續斷、黃芪的陰性樣品，按2.2.2 項下方法進行操作，分別制成熟三七、酒續斷、炙黃芪的陰性供試溶液。

2.2.4 陰性對照試驗 取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試溶液、空白溶劑按，2.1 項下的色譜條件進樣，記錄色譜圖，結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷與相鄰成分達基線分離，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 滇女金丸專屬性考察色譜圖

2.2.5 線性關系考察 分別精密吸取上述對照品儲備液適量，置于量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配置成含三七皂苷R10.087、0.109、0.237、0.546、1.092 mg·mL-1，人參皂苷Rg10.126、0.253、0.451、0.789、1.011 mg·mL-1，人參皂苷Rb10.063、0.125、0.251、0.502、1.003 mg·mL-1，川續斷皂苷Ⅵ0.065、0.131、0.522、0.783、1.357 mg·mL-1，黃芪甲苷0.102、0.204、0.326、0.407、1.018 mg·mL-1的對照品溶液。按2.1 項下色譜條件分別進樣10、20 μL，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標（Y），進樣質量為橫坐標（X），以外標兩點對數法進行線性回歸。得三七皂苷R1回歸方程：Y=1.875 5X+1.920 8（r=0.999 7）；人參皂苷Rg1回歸方程：Y=1.868 5X+1.909 0（r=0.999 6）；人參皂苷Rb1回歸方程：Y=1.789 8X+2.167 7（r=0.999 9）；川續斷皂苷Ⅵ回歸方程：Y=1.8296X+2.2751（r=0.9997）；黃芪甲苷回歸方程：Y=1.8130X+2.1128（r=0.9998）。結果表明三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷分別在0.087～1.092、0.126～1.011、0.063～1.003、0.065～1.357、0.102～1.018 mg·mL-1呈良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件每天進樣6針，共進樣3 d，以峰面積分別計算日內精密度及日間精密度。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷的日內精密度分別為1.40%、0.38%、2.18%、1.39%、1.69%，日間精密度分別為1.54%、1.32%、2.96%、2.76%、3.59%。結果表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 取2.2.2 項下滇女金丸供試品溶液，分別在0、4、8、10、12、24、48、72 h進樣，記錄色譜峰面積，結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷的RSD 分別為3.37%、2.04%、2.38%、1.86%、1.85%。結果表明樣品在72 h內穩定。

2.2.8 重復性試驗 取同一批滇女金丸（批號：190401），按照2.2.2 項下方法進行操作，平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，計算含量，結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷的RSD 分別為1.88%、2.35%、3.02%、1.67%、1.84%。結果表明該方法重復性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗 取已知含量的滇女金丸樣品（批號：190401）2.0 g，精密稱定9份，每3份加入相同量（分別為已知含量的50%、100%、150%）的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷對照品，按2.2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進行測定，以外標兩點對數法計算含量、回收率、RSD（表1）。均符合《中華人民共和國藥典》2020 年版（四部）的相關規定。

表1 滇女金丸中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ及黃芪甲苷的加樣回收率試驗

2.2.10 樣品測定 取3批樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以外標兩點對數法計算含量，結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷平均質量分數分別為0.123、0.541、0.437、1.427、0.135 mg·g-1，RSD＜4%，含量差異較小，均一度較高。結果見表2。

3 討論

3.1 提取條件考察

本實驗對熟三七、酒續斷、炙黃芪的提取條件進行考察，發現冷浸過夜后的效果明顯優于未冷浸過夜的樣品；通過對75%甲醇、甲醇、無水乙醇3種提取溶劑進行考察，發現甲醇的提取效率顯著高于其他溶劑；進一步試驗，以甲醇為提取溶劑，考察超聲提取（750 W，40 kHz）、索氏提取、回流提取等不同提取方法，發現超聲提取與索氏提取的提取效率相等，因此，選擇超聲提取；在提取溶劑體積、提取時間及提取次數方面，發現提取溶劑體積1∶25、提取2 h 和提取1 次最佳；鑒于經過水飽和正丁醇萃取和氨試液處理后的色譜圖干擾峰明顯減少，本實驗考察了萃取溶劑體積及萃取次數，結果表明，萃取3 次，每次40 mL 可萃取完全。因此，本實驗選擇甲醇作為提取溶劑，冷浸過夜，超聲（750 W，40 kHz）2 h，水飽和正丁醇萃取3 次，每次40 mL以制備供試品溶液。

3.2 檢測器選擇

本實驗以熟三七、酒續斷、炙黃芪中的皂苷成分作為檢測對象，紫外檢測波長均為末端吸收，基線干擾大，且黃芪甲苷在紫外檢測下響應小[12-14]，而在ELSD 下各個待測組分均顯示出了良好的響應值，且基線干擾小，因此，選用ELSD進行檢測。

3.3 系統適用性考察

通過檢測限與定量限試驗，得出三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續斷皂苷Ⅵ、黃芪甲苷檢測限分別為0.448、0.498、0.298、0.230、0.350 μg；定量限分別為0.897、0.996、0.596、0.460、0.700 μg，且RSD均小于3%。

本實驗還對流速、柱溫及不同品牌的色譜柱進行了考察，發現該方法在流速分別為0.9、1.0、1.1 mL·min-1時均有良好的適應性，且RSD＜3%；在柱溫為20、25、30 ℃時差異無統計學意義，RSD＜3%；通過對3 根不同品牌的色譜柱［Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Fortis Xi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil?C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）］考察后發現其RSD＜5%，方法具有良好的適用性。

3.4 皂苷類成分的含量限度

按《中華人民共和國藥典》2020 年版（一部）中熟三七、酒續斷和炙黃芪的含量測定限度規定計算滇女金丸中相應成分的含量，因滇女金丸為全粉入藥，根據藥材限度下浮10%計算，滇女金丸每1 g含熟三七以人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的總含量計，應不得少于0.86 mg；含酒續斷以川續斷皂苷Ⅵ計，不得少于0.29 mg；含炙黃芪以黃芪甲苷計，不得少于0.01 mg。從測定結果可知，3批滇女金丸的含量均合格。