Core 3 O-型糖鏈參與大腸桿菌對腸上皮細胞黏附和侵襲的影響

劉 韻 葉 鈞

1.陸軍軍醫大學第一附屬醫院消化內科，重慶 400038；2.陸軍第九五八醫院消化科，重慶 400020

黏蛋白O-型糖鏈根據在絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）分子上不同連接，可分為Core 1～8八種不同O-型糖鏈[1]。不同類型的O-型糖鏈由不同的糖基轉移酶催化合成，Core 3 O-型糖鏈由β-1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶6（β3gnT6）催化合成。腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸出血性大腸桿菌（EHEC O157∶H7）可引起患者從輕度腹瀉到嚴重疾病的發生，如出血性腸炎[2]；O-型糖鏈可能與腸道共生菌群的選擇相關，同時可以作為不同細菌的黏附位點[3]。本課題組前期研究發現，苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺（benzyl-α-GalNAc）抑制腸上皮細胞O-型糖鏈的合成，將導致細菌黏附于腸上皮細胞細菌數減少，同時侵襲入細胞內細菌數增加。因benzyl-α-GalNA抑制的是腸上皮細胞所有O-型糖鏈的合成，不能鑒別出是哪種O-型糖鏈在細菌的黏附和侵襲過程中發揮作用，本研究通過構建Core 3 O-型糖鏈過表達結腸上皮細胞株來探討Core 3 O-型糖鏈對細菌黏附和侵襲腸上皮細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

人類結腸癌細胞系HT-29（T25-flask，貨號CBP60011）和LS174T（T25-flask，貨號CBP60033）購買于上海中科院細胞庫。EPEC、EHEC O157∶H7、腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）來自陸軍軍醫大學微生物教研室。β3gnT6過表達慢病毒（1 ml，滴度為108，貨號L2016-745SH）由上海吉瑪公司合成，慶大霉素注射液購買于西南藥業有限公司（2 ml∶80 000單位，國藥準字H50021451），TEER測定細胞培養板（12孔，貨號3422）購買于美國Costar公司，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）染色液（1 ml，貨號S7109）購買于美國Sigma公司，McCoy’s 5A培養基（500 ml，貨號M9309）購買于美國Sigma公司，Triton X-100（100 ml，貨號T8200）購買于北京索萊寶公司。

1.2 β3gnT6過表達細胞系建立和鑒定

Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T、β3gnT6/LS174T細胞株的建立和鑒定具體方法參照本課題組前期文獻[4]。

1.3 細菌黏附試驗（克隆計數法）

當Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T細胞株生長融合至80%時，制備成細胞懸液，并接種于24孔板。待其生長融合至單層細胞時，加入PBS清洗3次，再加入無血清McCoy’s 5A培養基培養2 h，使細胞株適應無血清狀態，再向每個培養孔中加入相同濃度的EPEC或EHEC O157∶H7，37℃細胞培養箱中共孵育2 h。將培養板取出，倒掉培養基，用冷PBS清洗3次，抑制細菌進一步生長和去除未黏附的細菌，再通過細胞刮將黏附于細胞株表面的細菌刮下，再按照梯度稀釋的方法將其均勻涂布在MacConkey瓊脂板上，37℃細菌培養箱中過夜，最后用菌落計數法計數黏附于細胞表面的細菌數。

1.4 細菌黏附試驗（直接觀察法）

細菌與細胞共培養方法同上，去除未黏附細菌后，向培養孔中加入碘化丙啶（PI）室溫染色細菌30 min，再用PBS清洗3次，最后用熒光顯微鏡觀察和計數黏附于細胞表面的細菌數。

1.5 細菌侵襲試驗

當Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T細胞株生長融合至80%時，制備成細胞懸液，并接種于24孔板中。待其生長融合至單層細胞時，加入PBS清洗3次，再加入無血清McCoy’s 5A培養基培養2 h，使細胞株適應無血清狀態，再向每個培養孔中加入相同濃度的EIEC，37℃細胞培養箱中共孵育2 h，將培養板取出，倒掉培養基，用冷PBS清洗3次，再向培養孔中加入100 μg/ml慶大霉素，37℃細胞培養箱中共孵育2 h，以殺滅黏附于細胞表面的細菌，再用PBS清洗3次。然后向每孔中加入200 μl 0.25%的胰蛋白酶和0.025% Triton X-100，37℃細胞培養箱中孵育10 min，以破裂細胞和使細胞內的細菌釋放出來，再將裂解液均勻涂布在MacConkey瓊脂板上，37℃細菌培養箱中過夜，最后用菌落計數法計數侵襲入細胞內的細菌數。

1.6 TEER測定

當Ctr/HT-29、β3gnT6/HT-29、Ctr/LS174T和β3gnT6/LS174T細胞株生長融合至80%時，制備成細胞懸液，并將其接種于TEER測定細胞培養板中，當細胞株生長融合至單層細胞時，加入PBS清洗3次，再加入無血清McCoy’s 5A培養基培養2 h，再向培養孔中加入相同濃度的EPEC或EHEC O157∶H7，在不同時間點（0、3、6、12、24 h）測定其TEER值。

1.7 統計學方法

使用SPSS 22.0統計學軟件分析數據，采用樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細菌黏附實驗（克隆計數法）結果

黏附于β3gnT6/HT-29細胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細菌數明顯少于Ctr/HT-29細胞株（P＜ 0.01）；黏附于β3gnT6/LS174T細胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細菌數明顯少于Ctr/LS174T細胞株（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 黏附于細胞表面的EPEC和EHEC O157∶H7（＊＊P ＜ 0.01）

2.2 細菌黏附實驗（直接觀察法）結果

采用熒光顯微鏡觀察發現，黏附于β3gnT6/HT-29細胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細菌數明顯少于Ctr/HT-29細 胞 株（P＜ 0.01）；黏附于β3gnT6/LS174T細胞株表面的EPEC和EHEC O157∶H7細菌數少于Ctr/LS174T細胞株（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 熒光顯微鏡觀察黏附于細胞表面的EPEC和EHEC O157∶H7（＊P ＜ 0.05；＊＊P ＜ 0.01）

2.3 細菌侵襲實驗結果

侵襲入β3gnT6/HT-29細胞株內的EIEC細菌數多于Ctr/HT-29細胞株（P＜ 0.05）；侵襲入β3gnT6/LS174T細胞株內的EIEC細菌數明顯多于Ctr/LS174T細胞株（P＜ 0.01）。見圖3。

圖3 侵襲入細胞內的EIEC細菌數（＊P ＜ 0.05；＊＊P ＜ 0.01）

2.4 TEER實驗結果

在不同時間點（0、3、6、12、24 h）檢測細胞株TEER值發現，未在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6過表達細胞株TEER值的變化與其對照細胞比較，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6過表達細胞株TEER值下降較其對照細胞更明顯，差異有統計學意義（P＜ 0.01或P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 不同時間點細胞株TEER值變化

3 討論

在發展中國家，引起嬰幼兒腹瀉的主要致病菌是EPEC和EHEC O157∶H7[5]，盡管對于EPEC或EHEC O157∶H7感染患者有一些有效的治療手段，但為進一步優化治療策略，需要明確EPEC或EHEC O157∶H7在腸道多重防御屏障保護下是如何致病的。在人體腸道中，EPEC或EHEC O157∶H7致病的第一步是黏附于腸道黏液屏障中的糖鏈上，進而定植和感染腸道上皮細胞。另一重要步驟是細菌通過Ⅲ型分泌系統分泌相關效應蛋白，使細菌進一步侵襲入腸道黏液層，進而引起腸道炎癥的發生[6]。

腸道黏液屏障作為人體阻擋外界病原體、毒素的防御屏障，在人體生命活動中起至關重要的作用。結腸黏液屏障分為兩層，最外面的一層為疏松層，含大量細菌；最里面一層為致密層，無細菌定植[7-8]。黏液屏障主要由腸道杯狀細胞分泌的MUC2和IgGFcγBP及穿插在腸上皮細胞的膜相關黏蛋白（如MUC1、MUC3、MUC4）組成。分泌型黏蛋白和膜相關型黏蛋白有一個共同特點，就是在其內部含大量的串聯重復序列（VNTRS），該重復序列中含大量的O-型糖鏈和N-型糖鏈的修飾位點。黏蛋白分子質量大約80%由O-型糖鏈組成，因此黏蛋白分子的功能與O-型糖鏈密切相關[9-12]。同時有研究表明，腸道黏蛋白O-型糖鏈參與細菌與宿主相互作用過程[13-18]，在哺乳動物中，敲除Core 1或Core 3 O-型糖鏈將導致自發性結腸炎的發生[19]。

本課題組前期研究發現，通過benzyl-α-GalNAc抑制HT-29和HT-29-Gal細胞O-型糖鏈的合成，將導致EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細胞數量減少，同時抑制腸上皮細胞MUC2分泌[20-21]，因O-型糖鏈根據不同的連接在Ser/Thr殘基上，黏蛋白O-型糖鏈可區分為八種核心結構（Core1~8）[22-23]，benzyl-α-GalNAc抑制的是腸上皮細胞所有O-型糖鏈的合成，不能區分是哪一種或哪幾種O-型糖鏈參與細菌黏附和侵襲。因此本課題組進一步研究發現，抑制腸上皮細胞Core 2 O-型糖鏈的合成，將導致EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細胞數量減少[24]，這提示Core 2 O-型糖鏈參與EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細胞。本研究通過促進腸上皮細胞Core 3 O-型糖鏈的合成，進而明確Core 3 O-型糖鏈是否參與細菌黏附和侵襲腸上皮細胞。本研究顯示，促進腸上皮細胞Core 3 O-型糖鏈的合成將抑制EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細胞，同時增加EIEC侵襲入腸上皮細胞。這提示Core 3 O-型糖鏈可能不是EPEC和EHEC O157∶H7的黏附位點，Core 3 O-型糖鏈合成增加，將阻遏細菌黏附腸上皮細胞。同時Core 3 O-型糖鏈合成增強，導致EIEC侵襲入腸上皮細胞內細菌數增加，這可能是Core 3 O-型糖鏈的合成破壞了細胞屏障功能。因此，本研究測定不同時間點β3gnT6過表達細胞株與對照細胞株的TEER值，差異無統計學意義（P＞ 0.05）。而在EPEC或EHEC O157∶H7感染下，β3gnT6過表達細胞株的TEER值與其對照細胞比較明顯下降（P＜ 0.01或P＜ 0.05），提示增加Core 3 O-型糖鏈的合成將導致細胞屏障的通透性增加，Core 3 O-型糖鏈具有調節細胞黏膜屏障的作用。同時有文獻研究表明，在小鼠中，敲除C1galt1（合成Core 1 O-型糖鏈酶）將改變腸道通透性，進而增加腸道炎癥及腫瘤的發生[25]，而Core 1 O-型糖鏈與Core 3 O-型糖鏈的合成共用同一底物，抑制Core 1 O-型糖鏈的合成將增加Core 3 O-型糖鏈的合成[22-23]，該體外研究結果與其一致。細胞株TEER值的差異發生在細菌感染條件下，而不是非感染條件下，這種差異的發生有待后續進一步探究其機制。

總之，本研究結果提示Core 3 O-型糖鏈參與EPEC和EHEC O157∶H7黏附腸上皮細胞，同時Core 3 O-型糖鏈參與EIEC侵襲腸上皮細胞，或許為將來腸道感染疾病的治療提供新的靶點。