四川山地烏骨雞糞源大腸桿菌耐藥性分析

何晴 汪熙來 魯志平* 唐利軍 成杰 鄔旭龍 巫德勝 唐書宇 李建臻 郭英博 羅俊林 陳澤林 楊定勇

（1，成都農業科技職業學院 611130；2，四川省大英縣農業農村局 629300）

大腸桿菌又名大腸埃希氏菌，屬于人與哺乳動物胃腸道細菌中的一個共生寄棲菌。在某些特定條件下導致畜禽發病，并造成較大的經濟損失，同時，大腸桿菌可隨著人或動物的排泄物排出體外而直接污染環境。大腸桿菌病對畜禽養殖業由較嚴重的危害，主要疾病有豬大腸桿菌病、禽大腸桿菌病、兔大腸桿菌病等。大腸桿菌同時也是耐藥性基因的傳播載體。許多發達國家為了有效控制各種細菌耐藥性，建立了各種細菌耐藥性情況監測調度系統。對四川山地烏骨雞群糞源大腸桿菌病的耐藥性情況進行定期調查，有利于為四川山地烏骨雞疫病防治和細菌耐藥性監測提供一個較為理想的科學研究模型[1]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

營養瓊脂、營養肉湯、麥康凱瓊脂培養基、腸桿菌科細菌生化編碼鑒定管、革蘭氏染液、20 種抗菌藥藥敏紙片及每片的含藥量(單位：μg/片)，分別為青霉素類：青霉素(P，10)、哌拉西林(PIP，100)、羧芐西林(CB，100)、氨芐西林(AM，10)、苯唑西林(OX，1)；氨基糖苷類：慶大霉素(GM，10)、新霉素(N，30)、卡那霉素(K，30)、丁胺卡那(AK，30)；頭孢菌素類：頭孢唑啉(CZ，30)、頭孢呋辛(CXM，30)、頭孢曲松 (CTR，30)、頭孢他啶(CAZ，30)、頭孢哌酮 (CFP，75)、頭孢拉定(RAD，30)、頭孢氨芐(CA，30)；四環素類：米諾環素(MI，30)、多西環素(DX，30)、四環素(TE，30)；大環內酯類：紅霉素(E，15)；以上材料均購于杭州微生物試劑公司。

1.2 樣品采集

1.2.1 采樣區域

成都農業科技職業學院四川山地烏骨雞養殖場(A 場) 和遂寧市大英縣四個不同的四川山地烏骨雞養殖場(B、C、D、E 場) 采集樣品。

1.2.2 糞樣收集

采用隨機取樣法對每場按四川山地烏骨雞養殖量10%進行采樣，并分別編號后置于10ml 滅菌EP 管中避光冷藏運輸，24h 內進行相關處理[2]。

1.3 細菌的分離與純化

將無菌采集的四川山地烏骨雞泄殖腔拭子置于無菌生理鹽水中浸泡10～15min，在滅菌普通營養肉湯培養基中加入200μL浸泡液，37℃連續培養16～18h。用無菌接種環挑取少量菌液，用稀釋涂布平板法均勻的涂布在麥康凱培養基上，在37℃無菌恒溫箱連續培養24h，觀察每個麥康凱培養基上菌落形態、特征情況[3]。挑取單個光滑粉紅色菌落再經麥康凱培養基進行純化處理，用革蘭氏染色液染色、鏡檢，觀察菌落染色形態及特征，根據染色鑒定結果對分離菌進行初步鑒定；將符合大腸桿菌特點的菌落接種于營養瓊脂平板上，37℃下恒溫連續培養24h 后，置于4℃冰箱中保存備用。

1.4 細菌鑒定

用腸桿菌科系列專用細菌生化編碼微量反應鑒定管對已分離的大腸桿菌疑似物進行生化鑒定。將分離的各疑似大腸桿菌細菌液均勻接種于系列細菌生化編碼微量反應鑒定管，在恒溫箱中37℃進行培養，24h 后觀察結果。對所有反應結果均進行生化編碼，根據生化編碼反應值檢測搜索腸桿菌屬各科中的細菌生化順序編碼反應表格后即可直接獲得反應結果。對不確定性的菌種則可進行接種補充生化編碼反應進行鑒定。并將經過鑒定后的大腸桿菌科的菌落全部接種到普通肉湯培養基中進行富集。

1.5 藥敏試驗

采用CLSI 推薦的K-B 法進行藥敏試驗。取純化后的大腸桿菌菌液，用涂布接種法，將其均勻地涂布于普通瓊脂平板表面，37℃培養18～24h，觀察藥片周圍有無抑菌圈，并用游標卡尺測量藥片的抑菌圈直徑(取平均值)。試驗結果判定：每個藥片周圍抑菌圈直徑0≥20mm 為高度敏感，抑菌圈直徑15≤d＜20mm 為中度敏感，抑菌圈直徑10≤d＜15mm 為低度敏感，抑菌圈直徑0≤d＜10mm 耐藥。

2 結果

2.1 細菌分離與鑒定

大腸桿菌病的疑似物在麥康凱平板上的表現形態為邊緣整齊、表面光滑、濕潤且不透明、微帶粉紅色扁平狀的菌落，見圖1。經革蘭氏染色，鏡檢呈現粉紅色、兩端鈍圓、粗短的小桿菌。根據腸桿菌科細菌生化鑒定編碼微量鑒定管進行細菌生化編碼鑒定，按生化編碼值檢查搜索腸桿菌科細菌生化鑒定編碼微量表，表明分離菌株為大腸埃希氏菌。

圖1 分離菌在麥康凱平板上菌落特征

2.2 藥敏試驗

（1）用K-B 法對所鑒定的大腸桿菌菌株進行20 種常用抗生素的藥敏聯合試驗，分析結果表明，A 場糞源大腸桿菌對20種常用抗菌藥物具有高度敏感占15%，中度敏感占25%，低度敏感占10%；B 場中對抗菌藥物具有高度敏感占10%，中度敏感占20%，低度敏感占10%；C 場中對抗菌藥物具有高度敏感占10%，中度敏感占10%，低度敏感占15%；D 場中對抗菌藥物具有高度敏感占35%，中度敏感占20%，低度敏感占10%；E場中對抗菌藥物具有高度敏感占5%，中度敏感占5%，低度敏感占15%。

（2）分離的大腸桿菌對四環素、多西環素、氨芐西林、苯唑西林、羧芐西林、頭孢曲松、卡那霉素的耐藥率高達100.00%；而對鹽酸頭孢哌酮、頭孢呋辛、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢氨芐、哌拉西林、慶大霉素的耐藥率在20%～80%之間；對頭孢鹽酸鈉和頭孢他啶、新霉素、丁胺卡那、米諾環素的耐藥率均在20.00%以下。結果見附表，圖2。

圖2 糞源大腸桿菌的耐藥結果

附表 不同養殖場大腸桿菌藥敏結果統計表（單位：mm）

（3）試驗表明，監測的四川山地烏骨雞養殖場對多種不同類別抗生素耐藥，并且部分養殖場耐藥菌株呈現多重性耐藥，A、B、D 場對頭孢菌素類藥物使用規范，C、E 場對頭孢菌素類藥物使用不規范；B、D 場對氨基糖苷類藥物使用規范，A、C、E 場的用藥規范有待提高；A、C、D、E 場對米諾環素使用規范，B 場米諾環素過度使用；A、C、D 場對哌拉西林比較有規范。5 個養殖場中，A 場和D 場對抗生素的使用較合理規范，B 場次之；C 場和E 場對抗生素的合理使用有待提高。

3 討論

目前，大腸桿菌病再次成為畜禽生產中常見細菌性疾病之首，發病率逐年攀升，造成畜禽死亡率居高不下[4]。多個研究表明，細菌耐藥性可能從動物通過食物鏈、環境或者動物和人的直接接觸而傳播[5]。不同品種動物的致病菌對各種新型抗菌生物治療類藥物敏感性程度可能也會存在較大差異，在選擇和使用各種新型抗菌藥物對其進行抗菌治療時，需特別注意不同病原菌耐藥性的定期檢測。

養雞場一旦發生大腸桿菌病，首先要進行藥物敏感性試驗，篩選出兩種及以上對病原菌敏感的抗菌藥物，選擇幾種比較敏感的抗菌藥物同時進行使用或輪換使用，大大減少單一種藥物的使用持續時間，有效實現在臨床上的合理化和規范化用藥，有效減緩各種細菌產生耐藥性[6]。A 場和D 場在日常用藥過程中一直采用敏感藥物篩選等技術，對抗生素的使用較合理規范，多種抗生素均敏感或較敏感。

調查發現，四川山地烏骨雞養殖生產中養殖舍飼養環境、衛生質量高，飼養人員、車輛、禽舍、用具的清潔消毒處理頻率高，育雛期飼養密度及保溫措施適當，飼料無污染且營養合理全面等，病原菌耐藥性也隨之降低，和本試驗結果高度一致。