聚苯乙烯微塑料對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響①

黃 萌，程 思，李嘉琪，李 根，楊 揚，胡 鋒，李輝信，武 俊

聚苯乙烯微塑料對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響①

黃 萌，程 思，李嘉琪，李 根，楊 揚，胡 鋒，李輝信，武 俊*

(南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095)

以土壤模式動物秀麗隱桿線蟲為受試對象，研究了不同粒徑、不同濃度的聚苯乙烯(PS)微塑料在短期暴露和長期暴露條件下對線蟲取食偏好的影響，結果顯示，1、10、100 mg/L濃度下，1 μm和5 μm的PS微塑料短期暴露后，線蟲對JX1 (X1)和Y1 (Y1)的取食偏好并未發生明顯改變；1、10、100 mg/L濃度下，5 μm 的PS微塑料在長期暴露條件下能夠改變線蟲對X1、Y1的取食偏好且使線蟲取食相關基因(、、、、、和)的表達顯著上調；1 μm、100 mg/L和5 μm、100 mg/L的PS微塑料長期暴露后線蟲體內氧化應激相關指標均有上調，與PS粒徑大小無明顯關聯，提示氧化應激損傷可能并非PS微塑料長期暴露改變線蟲取食偏好的直接機制。這均表明PS微塑料可以通過調控線蟲取食偏好相關功能基因來對線蟲的取食偏好行為產生影響。

微塑料；秀麗隱桿線蟲；取食偏好

微塑料是粒徑小于5 mm的塑料纖維、顆粒和薄膜[1]，廣泛存在于海洋、淡水及陸地生態系統中[2-4]，甚至在大氣中也發現了微塑料[5]。塑料在環境中極不易分解，且因其具有尺寸小和比表面積大等特性，微塑料的環境危害普遍被認為比大型塑料更大。微塑料的小尺寸使得它們很容易被環境中各種各樣的生物攝取，不僅對生物具有生長發育毒性，且對動物的選擇性取食行為也造成了一定影響，如在濃度為50個/ml、粒徑為10 ～ 30 μm的聚酰胺纖維中暴露后，冷水橈足類對獵物的選擇性發生了顯著改變，對藻類的攝取率下降了40%[6]。Rotjan等[7]發現攝入微塑料后的珊瑚()抑制了對其食物鹽水蝦卵的攝入。動物的選擇性取食行為在自然界十分普遍，不管是擁有味覺的高等生物還是低等生物(如原生動物和線蟲等)在取食時都會依據本能選擇能夠為自身生長提供均衡營養的食物，并且具有獨特的偏好性[8]。微塑料對動物選擇性取食行為的改變可以顯著影響動物的進食和健康，對該種動物發揮重要作用的食物網和生態過程產生潛在的連鎖效應，最終對生態系統產生影響[6]。

微塑料也被發現對土壤模式生物秀麗隱桿線蟲具有生理與神經毒性，聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯微塑料暴露均能縮短線蟲壽命，抑制線蟲繁殖，引起線蟲體內氧化應激反應，并能引發線蟲慢性神經毒性，使線蟲的運動發生障礙[9-12]。但目前微塑料對線蟲的取食偏好方面產生的影響暫未見報道，食細菌線蟲對微生物的選擇性取食不僅影響到線蟲自身的健康及生存適應性[13-15]，還會改變微生物種間競爭的結果，并影響微生物在土壤中的分布，微生物的數量、活性以及群落結構，對分析土壤食物網的能量流動與養分轉化具有重要意義[16]，因此研究微塑料對線蟲取食偏好的影響及其機制可以為微塑料在環境中潛在的生態風險評價提供科學依據。

故本文選擇1 μm和5 μm兩種粒徑，1、10、100 mg/L 3個濃度以及短期和長期兩種暴露時間來研究環境中較為常見塑料類型—— 聚苯乙烯微塑料對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響，并從生化水平和分子水平探討了聚苯乙烯微塑料對秀麗隱桿線蟲的取食偏好的影響機制，以期為微塑料的毒性評價和風險評估提供新的思路和依據。

1 材料與方法

1.1 培養基及溶液

線蟲培養基1 L (NGM，nematode growth medium)：稱取NaCl 3 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂粉17 g，加入975 ml去離子水，121 ℃ 高溫滅菌20 min，冷卻至55 ℃ 左右，分別加入過0.22 μm無菌濾膜的1 ml 1 mol/L MgSO4、1 ml 1 mol/L CaCl2、1 ml 5 mg/ml膽固醇、25 ml 1 mol/L KPO4緩沖液 (pH 6.0)。1 mol/L KPO4緩沖液(pH 6.0)：稱取108.3 g KH2PO4、35.6 g K2HPO4，加入去離子水超聲溶解并定容至1 L。細菌培養基1 L (LB培養基，Luria-Bertani medium)：稱取NaCl 10 g、胰蛋白胨Tryptone 10 g、酵母膏5 g，用去離子水溶解并定容至1 L，121 ℃高溫滅菌20 min。M9緩沖液1 L：NaCl 5 g、KH2PO43 g、Na2HPO46 g、MgSO4(1 mol/L) 1 ml，加入去離子水溶解并定容至1 L，121 ℃高溫滅菌20 min，常溫放置備用。線蟲裂解液(9 ml)：7 ml無菌水中加入1 ml 5 mol/L的NaOH、1 ml 10% NaClO，混勻，現配現用。

1.2 微塑料及其表征測定

聚苯乙烯(PS) 顆粒購于天津倍思樂色譜技術開發中心，分為兩種直徑：1 μm和5 μm，均勻分散在水溶液中，帶有綠色熒光便于查看微塑料在線蟲體內的分布，最大激發波長和最大發射波長分別為488 nm和518 nm。利用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM) 對微塑料顆粒的形貌進行了表征(S4800，日立高科技公司，Japan)。使用激光粒度儀(Mastersizer 2000，英國馬爾文儀器有限公司，UK) 對微塑料顆粒的粒徑進行分析。

1.3 線蟲及菌株的培養

N2 (簡稱)來源于CGC (Caenorhabditis Genetics Center，Minneapolis，MN，USA)。3株供試細菌(表1)：OP50 (以下簡稱OP50)來源于CGC，JX1 (以下簡稱X1)和Y1 (以下簡稱Y1)均為本實驗室篩選出來的土壤優勢細菌。供試土壤采自江蘇省南京市雨花臺區板橋鎮長江南岸沖積地的灰潮土。

表1 供試細菌的基本性質

OP50為秀麗隱桿線蟲的實驗室標準食物，37 ℃ 培養；X1和Y1作為取食偏好實驗中線蟲的兩種食物，均為30 ℃ 培養。線蟲以OP50喂養，長至產卵期后進行同步化，將蟲體用裂解液裂解后，5 000 g離心1 min，棄上清。將得到的卵置于M9緩沖液中孵化，24 h后將得到的L1期幼蟲置于涂布有OP50并加入了不同濃度和粒徑的PS微塑料的線蟲培養基 (NGM) 中20 ℃ 培養，以供試驗。

1.4 PS微塑料短期暴露對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響

將秀麗隱桿線蟲同步化后置于含有不同粒徑和濃度的PS微塑料的培養基中培養36 h，長至L4期時用M9緩沖液將蟲子沖洗下來，并將附著的OP50清洗干凈。X1、Y1用液體LB在30 ℃ 培養至對數期，用分光光度計調節OD600值為1，在同一90 mm的NGM兩端等距圈中添加X1、Y1各20 μl，將得到的L4期線蟲置于培養基中心位置 (圖1，每個圈的直徑為15 mm，兩端圈與中心點的距離為20 mm)。將培養基置于20 ℃培養箱中黑暗培養，讓線蟲自由取食兩種細菌。接種線蟲后，于12 h后在體視顯微鏡下觀察線蟲遷移取食情況并記錄線蟲遷移至各個菌區的數目，統計分析線蟲對不同細菌的選擇性和偏好性。每組設置8個重復。計算對某種細菌的偏好比例：PI=/。式中：PI (preference index) 表示某一時刻線蟲對某種細菌的偏好比例，表示該時刻該種細菌菌區線蟲的數目，表示該時刻兩種細菌菌區線蟲數總和。

圖1 線蟲取食偏好的試驗示意圖

1.5 PS微塑料長期暴露對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響

將線蟲在含有不同粒徑和濃度的PS微塑料平板上傳代培養15 d，同步化后待線蟲置于含有不同粒徑和濃度的PS微塑料的培養基中培養36 h，長至L4期洗下備用，取食偏好試驗方法同上。

1.6 PS微塑料長期暴露對秀麗隱桿線蟲氧化應激水平的影響

將線蟲在含有不同粒徑和濃度的PS微塑料平板上傳代培養15 d，同步化后待線蟲置于含有不同粒徑和濃度的PS微塑料的培養基中培養36 h，長至L4期洗下備用。按照線蟲活性氧(ROS) ELISA試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD) ELISA試劑盒、過氧化氫酶 (CAT) 活性檢測試劑盒說明書使用酶標儀確定對照組和各暴露組的活性氧自由基水平、超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性。試劑盒購于江蘇酶標生物科技有限公司。每個樣設置3個重復。

1.7 熒光定量PCR

用Trizol法提取PS微塑料處理15 d并同步化后培養至L4期的秀麗隱桿線蟲的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TARAKA，RR047Q)操作說明將線蟲的RNA反轉錄成cDNA，選取、、、、、和這7個與取食行為相關的基因作為靶基因，其中基因參與五羥色胺信號通路，編碼鳥苷酸環化酶，和基因共同編碼TOLL樣受體信號通路中一個含TIR結構域的蛋白質，、和均參與轉化生長因子-β (TGF-β)信號通路[17-21]。使用ABI StepOne PLUS熒光定量PCR儀對這些基因的表達量進行相對定量分析，內參基因為，每個樣設置3個重復。基因的引物序列見表2。

表2 取食相關功能基因的引物及產物預期大小

1.8 數據分析與處理

采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)分析，用Duncan檢驗法對不同處理間平均值的顯著性差異(<0.05)進行檢驗。數據統計分析均使用SPSS 20統計軟件，使用Origin和Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同粒徑的PS微塑料的表征

污染物的毒性與其本身的理化性質密切相關，PS微塑料的形貌用掃描電鏡觀察結果如圖2A和2B所示，兩種粒徑的PS微塑料均呈規則的圓球形；PS微塑料的粒徑使用粒徑分析儀進行分析，結果如圖2C和2D，圖2C顯示1 μm的 PS微塑料粒徑呈正態分布，(0.5) = 1.145 μm，圖2D顯示5 μm 的PS微塑料粒徑呈正態分布，(0.5) = 4.724 μm。

(圖A、B分別表示粒徑為1 μm和5 μm的PS顆粒的電鏡掃描圖；圖C、D分別表示粒徑為1 μm和5 μm的PS顆粒的粒徑分析儀圖)

2.2 PS微塑料短期暴露對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響

秀麗隱桿線蟲分別在未添加PS微塑料的培養基和含有不同濃度和粒徑的PS微塑料培養基中短期暴露36 h后，將線蟲同步化后進行取食偏好試驗 (圖3A)。鑒于此取食偏好試驗中4、8、12、24 h時線蟲對X1、Y1的偏好性趨勢較為一致，均偏好Y1，故在此只列出最具代表性的12 h時的取食數據。試驗結果顯示，對照組和所有處理組的線蟲均表現出對Y1的明顯偏好，即1 μm和5 μm的PS微塑料在1、10、100 mg/L這3個濃度下均對線蟲對X1、Y1的取食偏好行為無明顯影響。在中高濃度(10 mg/L和100 mg/L)下，盡管線蟲仍然偏好取食Y1，但1 μm和5 μm的PS微塑料暴露組的線蟲對Y1的偏好性相較于對照組顯著降低(<0.05)。

(A. 不同粒徑和濃度的PS微塑料短期暴露；B. 不同粒徑和濃度的PS微塑料長期暴露；圖中誤差線表示標準誤，*、**、 ***分別表示每組內X1與Y1菌區線蟲數量的差異達P<0.05、P<0.01和P<0.001顯著水平)

試驗結果表明，1 μm和5 μm的PS微塑料短期暴露對線蟲取食偏好行為并未有明顯改變，猜測可能是暴露時間較短。

2.3 PS微塑料長期暴露對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響

將秀麗隱桿線蟲在含有不同濃度和粒徑的PS微塑料培養基中長期暴露約15 d后，將線蟲同步化后進行取食偏好試驗 (圖3B)。未經PS微塑料暴露的線蟲對X1、Y1的取食偏好結果顯示，線蟲更加偏好取食Y1 (PI為0.63)；長期暴露在粒徑為1 μm的PS微塑料環境中的線蟲對X1、Y1的取食偏好性未發生改變，仍顯著偏好Y1，1、10、100 mg/L的暴露組線蟲對Y1的PI分別為0.60 (<0.05)、0.64 (<0.001)、0.59 (<0.01)；而長期暴露在粒徑為5 μm的PS微塑料環境中的線蟲對X1、Y1的取食偏好行為發生了改變，具體表現為：1 mg/L和10 mg/L的兩個暴露組的線蟲對X1、Y1的取食未見明顯偏好性，而較高濃度即100 mg/L的暴露組的線蟲顯示出對X1的顯著偏好(PI為0.68，<0.01)。這表明，PS微塑料能夠改變線蟲的取食偏好，且與微塑料的粒徑和濃度相關，較大粒徑、較高濃度的PS微塑料對秀麗隱桿線蟲的取食偏好行為影響程度較大。

2.4 PS微塑料長期暴露對秀麗隱桿線蟲氧化應激水平的影響

對在不同粒徑和濃度的PS微塑料中暴露15 d的秀麗隱桿線蟲體內的活性氧自由基(ROS)水平進行測定，結果表明，PS微塑料濃度為100 mg/L時，粒徑為1 μm和5 μm的PS微塑料暴露組的線蟲體內的活性氧自由基水平顯著提高(<0.01)，其中1 μm、100 mg/L的暴露組線蟲體內的ROS水平與對照組相比提高了10.62%；5 μm、100 mg/L的暴露組線蟲體內的ROS水平與對照組相比提高了11.48%，與1 μm、100 mg/L的暴露組相比線蟲體內的ROS含量升高了0.78% (圖4A)。

對在不同粒徑和濃度的PS微塑料中暴露15 d的秀麗隱桿線蟲體內的超氧化物歧化酶(SOD)活性進行測定，結果表明，秀麗隱桿線蟲在粒徑為1 μm和5 μm，濃度為1、10 和100 mg/L的6個PS微塑料處理組中暴露15 d，對線蟲體內的SOD酶活的影響均無顯著差異 (圖4B)。但是可以看到，PS微塑料粒徑為1 μm和5 μm時，線蟲體內SOD酶活均隨著PS微塑料濃度的升高而升高。

(A. 活性氧自由基水平；B. 超氧化物歧化酶活性；C. 過氧化氫酶活性；誤差棒表示標準誤，*、**、 ***分別表示處理與對照組差異達P<0.05、P<0.01和P<0.001顯著水平，下圖同)

對在不同粒徑和濃度的PS微塑料中暴露15 d的秀麗隱桿線蟲體內的過氧化氫酶(CAT)活性進行測定，結果顯示，當PS微塑料粒徑為1 μm時，各濃度暴露組的線蟲體內CAT的含量隨著PS微塑料濃度的升高而升高，1 mg/L和10 mg/L的PS微塑料暴露組與對照組相比無顯著差異(圖4C)；但100 mg/L的PS微塑料暴露組則與對照差異顯著(<0.05)，與對照組相比，線蟲體內CAT含量升高了0.4889%。當PS微塑料粒徑為5 μm時，低暴露濃度(1 mg/L)和高濃度暴露組(100 mg/L)線蟲體內的CAT含量與對照組相比均有顯著差異，分別比對照組升高了51.12% (<0.05)和70.92% (<0.01)。

2.5 取食相關功能基因的表達

為了闡明PS微塑料改變線蟲取食行為的分子機制，我們選取了一些與線蟲取食行為相關的基因，提取經過PS微塑料長期暴露的線蟲RNA進行熒光定量PCR，對這些基因的表達量進行相對定量分析 (圖5)。研究結果顯示，粒徑為1 μm的PS微塑料暴露組，大部分基因的表達量與對照組相比均無明顯差異，只有10 mg/L暴露組的、和3個基因的表達量和100 mg/L暴露組的基因表達量與對照組相比顯著降低 (<0.05)；而5 μm的PS微塑料暴露組在1、10和100 mg/L濃度下，、、、、、和這7個基因表達量均明顯上調，其中基因表達量上調幅度最大，1、10和100 mg/L暴露組與對照組相比分別上調195.14% (<0.05)、202.36% (<0.05)和488.21% (< 0.001)，且、、、、和這6個基因表達量的上調均表現出對暴露濃度的依賴性，即PS微塑料暴露濃度越高，基因表達量越高。

圖5 不同粒徑和濃度的PS微塑料長期暴露后線蟲取食相關功能基因的相對表達量

3 討論

試驗結果顯示，5 μm的PS微塑料長期暴露15 d后，線蟲對X1、Y1的取食偏好發生了明顯改變，這表明PS微塑料對線蟲取食偏好的影響與PS微塑料的暴露時間、粒徑和濃度均有關聯。與1 μm相比，5 μm的PS微塑料對線蟲取食偏好的影響更大，且隨著暴露時間的延長和暴露濃度的增大，其影響也越大。猜測可能是由于較大粒徑的微塑料更易累積阻塞腸道，使機體產生飽腹感，從而影響線蟲的取食，有研究也發現微塑料易積累在魚類的鰓部和消化道，阻塞消化系統并使其產生飽腹感，且對食物的攝入量減少[22]。微塑料長期暴露對線蟲取食偏好的影響較短期來講更大，這與一些環境毒物相一致，如曹雪[23]發現壬基酚對秀麗隱桿線蟲的毒性是時間依賴性的，急性暴露以刺激效應為主，而慢性暴露則以抑制效應為主，且隨著壬基酚暴露時間的延長，線蟲生理生化指標的負面影響更為明顯，本文研究與此相印證，即長期PS微塑料暴露對線蟲取食偏好的影響較短期更大。

PS微塑料長期暴露后線蟲體內的ROS水平明顯升高，且抗氧化酶CAT的水平也顯著升高，表明PS微塑料使線蟲產生了氧化應激反應并激發了抗氧化系統。但1 μm和5 μm的PS微塑料在高濃度(100 mg/L)下均與對照組有顯著差異，這與只有5 μm的PS微塑料能夠改變線蟲取食偏好的現象并不完全一致，雖然氧化應激效應常與神經行為學上的異常緊密關聯[24]，但在此試驗中，氧化應激并不是PS微塑料改變線蟲取食偏好的直接機制。

Abada等[25]指出，線蟲的基因調控是食細菌線蟲進行選擇性和偏好性取食的主要原因。Coolon等[26]也發現，取食不同的細菌后，其許多基因表達量會發生變化，他們通過某些基因缺失的突變體證明了這些基因與的取食偏好性有關。本試驗中5 μm的PS微塑料也是由于直接影響到線蟲取食偏好相關的功能基因的表達，從而改變了線蟲對X1、Y1的取食偏好。熒光定量PCR試驗結果顯示，5 μm的PS微塑料顆粒長期暴露后的線蟲與取食相關的功能基因表達量上調。熒光假單胞菌已被發現是秀麗隱桿線蟲的一種病原菌，并且基于本實驗室之前的研究結果，秀麗隱桿線蟲以熒光假單胞菌Y1作為食物時，存活率明顯低于以解淀粉芽孢桿菌X1作為食物時[27]，故可以認為，相較于X1，Y1對秀麗隱桿線蟲有一定的毒害作用。而基因參與合成的五羥色胺調節線蟲運動行為來應對環境刺激[18]，編碼的鳥苷酸環化酶參與線蟲的嗅覺吸引行為，當基因突變時，線蟲會出現嗅覺學習逃避缺陷[28]，而基因突變體也被發現無法感知氣味偏好[17]，故當tax-4基因和基因表達上調時，線蟲對病原菌Y1的嗅覺識別增強，從而逃離對它有害的病原菌Y1。和基因共同編碼的TOLL樣受體信號通路中一個含TIR結構域的蛋白質，該信號通路也與線蟲的物理性逃避行為相關，可以識別病原菌分泌的模式分子從而識別和逃避有害因素[19]。同樣地，當和基因表達上調后，線蟲識別和分辨病原菌Y1的能力增強，可以有效避開有害菌Y1。、和均參與轉化生長因子-β (TGF-β)信號通路，該信號通路是參與調控細胞的生長、分化和死亡的非常重要的信號通路之一[21]。根據文獻[29]報道，基因突變后，出現了學習型逃避缺陷；基因突變后，線蟲出現了嗅覺適應性損傷[30]。在5 μm的微塑料中暴露的線蟲體內、和基因表達量上調后，線蟲的學習型逃避能力增強，此時若線蟲取食了病原菌Y1后，能夠增加趨避Y1的能力，從而取食偏好發生改變。以上這些與取食相關的基因的表達量均隨著5 μm的PS微塑料的濃度升高而增大，表明微塑料的濃度越大，對線蟲取食相關基因的影響越大，這些均與線蟲取食偏好改變的行為相一致，表明微塑料確實是通過影響線蟲的取食功能基因從而影響對X1和Y1的取食偏好行為，但是線蟲中這些取食相關功能基因具體如何協調起作用還有待深入研究。

綜上所述，微塑料暴露能夠改變線蟲的取食偏好，且較大粒徑的微塑料長期暴露對秀麗隱桿線蟲的影響更大，這種改變并不是由氧化應激引起的，而是由與偏好性取食相關的功能基因直接調控的，而線蟲的取食偏好對細菌的數量、活性及群落結構有重要影響[16]，且自然界中的塑料極不易分解，在環境中長期存在，這暗示了微塑料對整個土壤生態系統可能產生的影響。

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Effects of Polystyrene Microplastics on Feeding Preference of

HUANG Meng,CHENG Si, LI Jiaqi, LI Gen, YANG Yang, HU Feng, LI Huixin, WU Jun*

(College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, soil model animalwas used as test subject, and the effects of different particle sizes and concentrations of polystyrene (PS) microplastics on the feeding preferences ofunder short-term and long-term exposure conditions were studied. The results showed that, the feeding preferences ofonJX1 (X1) andY1 (Y1) did not change significantly after short-term exposure to PS microplastics of 1 μm and 5 μm at 1, 10 and 100 mg/L; At the concentrations of 1, 10 and 100 mg/L, PS microplastics of 5 μm could change the feeding preferences ofon X1 and Y1, and significantly upregulated the expression of feeding related genes (,,,,and) inunder long-term exposure. The indexes related to oxidative stress inwere all upregulated after long-term exposure to PS microplastics of 1 μm and 5 μm at 100 mg/L, but had no significant correlation with the particle size of PS, suggesting that oxidative stress damage may not be the direct way responsible for the effect of PS microplastics on feeding preference of. These results suggested that PS microplastics could affect the feeding preference behavior ofby regulating the functional genes related to feeding preference.

Microplastics;; Feeding preference

黃萌, 程思, 李嘉琪, 等. 聚苯乙烯微塑料對秀麗隱桿線蟲取食偏好的影響. 土壤, 2022, 54(1): 47–54.

S154.5

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.01.007

國家自然科學基金項目(41877057，31901179)、中央高校基本科研業務費(KJQN202016)和中國博士后科學基金項目(2019M661861)資助。

(wujun2013@njau.edu.cn)

黃萌(1996—)，女，湖北黃岡人，碩士研究生，主要研究方向為微生物分子生態。E-mail: 2018103028@njau.edu.cn