植物在非生物脅迫下代謝組學與轉錄組學的研究進展

張菡倩，秦玉瑩，黃 凱，陳建軍

（云南農業大學 資源與環境學院，云南 昆明 650201）

0 引言

非生物脅迫是所有不利于植物生長的非生物條件的總稱，它指與植物的正常生長和發育的條件相比，會破壞植物體內穩態平衡現象的條件。如鹽分、紫外線輻射、水分、重金屬、極端溫度等［1］。當植物處于逆境條件下，非生物脅迫會阻礙植物的生長發育，因此，植物必須根據當前的應激條件對代謝網絡進行配置，維持必要的代謝，采用新的穩態來適應逆境［2］。植物對環境脅迫的細胞和分子反應已經得到了廣泛的研究［3］。理解植物感知環境信號并將信號傳遞給細胞以產生適應性反應的機制，對生物學具有基礎的重要性［4］。

植物細胞產生不同的脅迫誘導的自衛機制，以減少脅迫的影響。這些防御機制是通過改變基因表達模式來發展的，造成蛋白質合成的定性和定量偏差，從而影響某些代謝和防御途徑的調節［5］。目前代謝組學發展迅速，已經被應用于植物［6］、動物［7］和醫學［8］等研究領域。新的代謝分析技術為生物學家了解植物在脅迫條件下的防御機制提供了支撐［9］。代謝組學技術目前能夠使用不同的多變量分析，這些分析來自各種聯用和色譜發現系統，例如氣相色譜或液相色譜與質譜聯用系統，或以核磁共振（NMR）為基礎的系統［3］。轉錄組學的研究對于理解基因組的功能成分和揭示細胞的分子組成是必不可少的［10］；轉錄組學是基于DNA微陣列技術的mRNA表達水平的高通量測序技術［11］。轉錄組學提供了定性定量分析多種mRNA基因表達差異的能力［12］。其主要目標是精確全面地描述轉錄組，包括所有種類轉錄本的注釋、基因轉錄結構的測定以及不同條件下每個轉錄本差異表達水平的量化［13］。目前轉錄組學已廣泛應用于植物學［14］、生物學［15］和醫學［16］等基礎研究領域。

1 代謝組學

1.1 代謝組學的概念

代謝組學（Metabolomics或Metabonomics）是全面了解生物體代謝網絡調控的有力工具，為我們提供了植物關鍵成分對非生物脅迫的代謝反應的全面概述［17］。代謝組學可以對一定時空下植物的特定組織或細胞進行代謝產物的定性定量分析，可以從宏觀角度研究植物的脅迫機制，更有利于揭示各種脅迫下植物代謝的復雜性［18］。

1.2 代謝組學的技術平臺

由于生物體內小分子代謝物的化學結構和特性種類繁多，因此至今仍沒有單一的技術可以對所有這些分子進行鑒定和定量。即使是最全面的方法，也只能檢測到1 000~2 000個分子特征［19-20］。代謝組學的各種檢測手段通常結合使用，因為它們在很大程度上與每個獨立的方法互補，優先覆蓋不同類型的代謝物［21］。其常用方法的優點和局限性如表1。

表1 代謝組學的主要技術平臺及其特點［22］

1.3 代謝組學在植物抗逆性研究中的應用

隨著技術的發展，各種組學技術被應用于植物研究中［23］。長期以來，初級和次級代謝產物被認為是基因和蛋白質活性的最終產物，與其他組學技術相比，代謝組學可以更全面地了解代謝網絡是如何調控的，可以直接反映出生物體的生理生化功能［24］。目前代謝組學已廣泛應用于植物［25］、食品［26］、微生物［27］和醫學［28］等相關領域。

植物的正常生長發育和繁殖需要陽光、氧氣、水分和礦質元素等條件，但當這些條件超過了植物的需求時，就會對植物產生脅迫，同時植物也會對這些脅迫條件作出相應的響應，這些響應便是植物的抗逆性。Rabara等［29］對煙草和大豆進行了代謝組學研究，證明了4-羥基2-酮戊二酸和香豆雌酚分別可以作為茄科植物和豆科植物響應干旱脅迫的代謝標記物。Yang等［30］對兩個品種的大豆進行代謝組學的研究，發現普通野生大豆主要通過刺激檸檬酸循環從而產生更多的ATP來忍耐鹽脅迫，而耐鹽性的大豆主要是通過調控氨基酸和有機酸的代謝來產生更多的可溶性物質從而忍耐鹽脅迫。Cevallos等［31］通過對柑橘葉片在患黃龍病和缺鋅條件下的差異代謝組學研究發現，柑橘葉片在黃龍病下具有區別于缺鋅條件下的生物標志物，如α-草烯、β-欖香烯、脯氨酸和反-丁香油烴等，這些物質可以作為柑橘葉片黃龍病的重要診斷依據。Wang Y等［32］分別對鎘、鉛脅迫下的蘿卜根進行代謝組學研究，結果表明鉛或鎘脅迫會引起糖、氨基酸和有機酸等代謝物的改變；通過KEGG對代謝通路的富集研究表明，在鉛脅迫下碳水化合物代謝、能量代謝和谷胱甘肽代謝發生了顯著變化，而在鎘脅迫下能量代謝、氨基酸代謝及氧化磷酸化相關途徑發生了變化。對逆境下植物的代謝組學的研究，擴展了植物對逆境的分子響應機制，有助于進一步剖析植物在逆境下的耐受機制。

2 轉錄組學

2.1 轉錄組學的概念

轉錄組是生物體及細胞在特定時空下完整的RNA轉錄本，代表了表型與DNA編碼信息之間的重要聯系，可以揭示生物過程中的分子機理［33］。自提出以來，轉錄組學在各學科研究領域中發展迅速，如植物育種［34］、食品安全工程［35］、環境與微生物的相互作用［36］等。轉錄組方法對于理解應激響應中發生的分子和細胞變化非常重要。這些方法主要依靠采用Northern blot / RNA blot和逆轉錄PCR（RT-PCR）等傳統方法，可以研究不同組織和細胞中基因的表達情況，而其表達程度的確認可通過定量PCR或實時PCR來實現［37］。此外，全基因組表達譜分析工具，如微陣列分析、下一代測序和RNA測序等，在這方面提供了巨大的幫助。

2.2 轉錄組學的技術平臺

轉錄組學技術都是開放平臺，旨在以高通量、低成本的方式直接對核酸進行測序［38］。每個平臺都采用了不同的方法，但都保持了3個主要策略：模板準備、測序和成像以及序列的對齊和組裝。目前轉錄組學所用的主要技術及其特點如表2所示。

表2 轉錄組學的主要技術平臺及其特點

2.3 轉錄組學在植物抗逆性中的應用

在分子水平上，基因表達的調節對于植物的調節過程非常重要，決定了植物的生長發育進程。隨著現代生物技術的不斷發展，對植物的逆境響應研究已經從表觀形態結構的適應發展到微觀的內在生理適應、生理適應網絡及轉錄水平、翻譯水平等分子層面上。目前轉錄組被廣泛應用在大豆［42］、小麥［43］等糧食作物，草坪草［44］等園藝植物及藥用植物［45］等上。

在非生物脅迫下，植物通過改變自身形態、生理生化水平從而適應不利的生存環境。Kovalchuk等［46］對長期暴露于鎘和鉛脅迫的植物的全球基因組表達分析表明，Cd脅迫下分別有65個基因上調和338個基因下調，Pb脅迫下有19上調基因和76個下調基因；其中，在經過Pb處理的植物中，半數改變其表達的基因在經過Cd處理的植物中也發生了改變；與Pb相比，Cd調控的基因數量越多，說明植株的基因組不穩定性越高，吸收能力也越強。張國儒等［47］對鹽脅迫下的番茄葉片進行轉錄組學研究，測序樣品中共4367個基因在樣品間表達出顯著差異，經過通路富集分析，認為Solyc02g014190.2、Solyc03g083420.2、Solyc08g 066270.1、Solyc09g082890.1和Solyc10g018530.1為番茄的耐鹽相關基因。Wang等［48］使用實時逆轉錄q-PCR技術對鐵缺乏條件下的擬南芥進行研究，結 果 表 明BHLH038、BHLH039、BHLH100和BHLH101可能參與介導缺鐵誘導的應激反應或與植物體內鐵穩態相關的信號傳導。

3 植物對不同非生物脅迫的響應

當植物面臨不利的生長條件時，非生物脅迫會阻礙植物的生長和生產力。植物會根據當前的壓力狀況重新配置代謝網絡，以維持必需的代謝并通過采用新的穩態來適應環境［49］。植物對逆境的響應涉及到不同的信號感受、信號傳導以及基因的表達與調控，具有龐大的調控網絡［50］。溫度、水分及重金屬等是對植物生長和作物生產有不利影響的常見脅迫條件。

3.1 植物在溫度脅迫下的代謝與轉錄組學研究

溫度脅迫幾乎可對植物生長的所有階段造成嚴重損害，溫度脅迫不僅使植物的生長發育受阻，還會造成細胞內穩態的不可逆損害、代謝途徑的破壞、結構和功能蛋白質的降解以及細胞膜脂過氧化，造成細胞死亡，甚至可能導致植物的死亡［51］。

在高溫脅迫下，植物主要通過調節抗氧化系統、熱激蛋白、滲透調節物質這四部分來適應高溫環境［52］。李川等［53］的研究結果表明熱激轉錄因子（Hsfs）、熱激蛋白（Psps）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸基因家族（PIP2）和生長素（IAA）基因在花粒期玉米對高溫脅迫的響應過程中起重要作用。Rizhsky等［54］對高溫脅迫下擬南芥進行GC-MS研究，結果表明丙氨酸、甘油、麥芽糖、蔗糖和海藻糖含量均增加。除此之外，植物激素如脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和乙烯等，也與不同植物中的HS信號有關［55］。Larkindale等［56］的研究表明，在豌豆和匍匐草本植物從熱脅迫處理恢復過程中，ABA水平出現峰值；同時，測量到了對高溫脅迫的響應而升高的SA水平［57］。Liu等［58］的研究表明，SA作用于ABA下游和磷脂酰肌醇4，5二磷酸特異性磷脂酶。HSPs是植物中一種熱休克蛋白，所有主要SHSP的轉錄本在熱脅迫期間均大量積累，并且特定的SHSP也在發育和其他一些脅迫下表達［59］。Sanmiya等［60］研究表明線粒體HSPs的過表達增強了煙草的耐熱性。高溫脅迫誘導了植物體內的多種分子和離子進行傳感和信號傳遞，細胞內Ca2+濃度的升高是溫度脅迫下的主要信號［61］。鈣離子濃度和鈣依賴性蛋白（CDPK）可以調節熱休克蛋白的表達［62］。此外，胞漿中的Ca2+濃度的增加有助于植物細胞在熱損傷期間更好地存活，這是通過增加抗氧化劑的活性來保護細胞的滲透平衡［63］。

3.2 植物在水分脅迫下代謝與轉錄組學研究

水分是生命中不可缺少的物質，水分虧缺對植物造成的影響最大，且植物對水分虧缺較敏感。在水分脅迫下植物體內氨基酸的水平會有不同程度的上升，氨基酸不僅是植物的組成部分，也是植物的重要代謝物，具有信號傳導、細胞滲透調節、礦物質營養吸收和重金屬解毒等多種功能［64］。Deluc等［65］的研究表明氨基酸的水平會在水分脅迫下發生變化。王征宏等［66］研究表明，經NaCl處理后的玉米葉片的游離氨基酸總量急劇上升，與對照相比，處理后第4天游離氨基酸含量的提高了兩倍，達到峰值。

植物對水分脅迫的響應范圍非常廣，除抗氧化系統、滲透調節物質等普遍適應逆境的響應外，光合作用、氮代謝也是響應水分脅迫的重要環節。王曉嬌等［67］對水分脅迫下的苗期馬鈴薯根系進行了轉錄組學研究，結果表明在中度水分脅迫及重度水分脅迫下分別有1488、5241個顯著表達差異的基因，在兩個水分脅迫條件下共同出現的差異基因有369個，通過KEGG代謝富集分析，這些基因富集在谷胱甘肽代謝、植物激素信號轉導等途徑。劉永紅等［68］研究發現，干旱脅迫會導致花期玉米葉片的葉綠素含量降低，光化學效率和光系統潛在活性大大降低。Hsiao［69］研究發現，水分虧缺可誘導蛋白質水解酶性大大增強，導致蛋白質大量分解并增加可溶活性氮含量。棉花在水分脅迫下的轉錄組共有519個差異表達基因，這些基因與脅迫、防御、代謝有關，同時與熱休克蛋白和活性氧有關的途徑也受到影響［70］。Padmalatha等［71］對干旱脅迫下纖維伸長過程中的棉花進行轉錄組學研究，結果表明編碼轉錄因子、滲透調節劑、離子轉運蛋白、熱休克蛋白和激素生物合成的基因也高度上調，參與苯丙酸合成、類黃酮生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉化、淀粉和蔗糖代謝途徑的基因下調等過程。

3.3 植物在重金屬脅迫下代謝與轉錄組學研究

通常，重金屬會抑制植物細胞酶的活性，誘導細胞氧化和代謝紊亂，從而導致植物生長發育遲緩，甚至在極端情況下導致植物死亡［72］。重金屬脅迫會影響植物細胞分裂、光合作用、蒸騰作用、種子萌發及根系生長等多種生理過程［73］；還會使植物產生氧化脅迫，催化苔騰反應產生羥基自由基，導致脂類、蛋白質和DNA受到損害［74］；同時，在重金屬脅迫下，植物可合成各種代謝物及信號分子，如抗氧化物質、滲透調節物質、有機酸、酚類物質等［75］。

玉米在鎘、銅、鉛等脅迫處理下，綠原酸、蘆丁等酚類物質的含量均上升［76］。由于酚類化合物中羥基與羧基的存在，這些羥基和羧基可以與金屬離子結合，所以在重金屬脅迫條件下，酚類化合物可以螯合重金屬離子，從而抑制苔騰反應［77］。除此以外，氨基酸及其衍生物可以螯合重金屬離子，從而提高植物對重金屬的耐受性，其中脯氨酸與組氨酸可以螯合細胞和木質部汁液中的金屬離子［78］。Bhagyawan等［79］研究表明在重金屬脅迫下鷹嘴豆幼苗體內脯氨酸含量增加。在重金屬脅迫下脯氨酸含量的增加可以減少自由基的形成，并通過提高谷胱甘肽的水平維持氧化還原環境［80］。Ahmad等［81］研究發現，高濃度的鉛脅迫會降低玉米的光合速率和水分利用效率，增強蒸騰效率。Norton等［82］對砷有不同耐性的兩個水稻品種進行了轉錄組學研究，發現大量轉錄因子、應激蛋白和轉運蛋白的表達出現差異，其中參與谷胱甘肽合成、代謝和轉運的基因反應表明，谷胱甘肽結合和砷酸鹽甲基化可能是水稻對砷的重要應激反應。植物受到重金屬脅迫下，MAPK級聯對激素合成中的信號轉導通路具有重要意義［83］。Jonak等［84］研究表明，紫花苜蓿在銅或鎘脅迫下4種MAPK亞型均被激活，且MAPK級聯對激素合成中的信號轉導通路具有重要意義。

4 總結與展望

綜上所述，迄今為止的試驗使我們能夠對非生物脅迫下的大量代謝物變化進行分類研究。應激反應的代謝變化可分為3個階段：環境變化的直接影響、對應激條件的短暫適應和在長期應激條件下建立的新的穩態。但由于上游反應的上調和下游反應的下調都會導致代謝物的累積，代謝物的分布并不能準確地揭示相關代謝途徑是上調還是下調，因此，代謝組學與轉錄組學的聯用可以揭示有關植物在非生物脅迫下的各種變化，對植物非生物脅迫的耐受性有一個清晰的認識。轉錄組學分析廣泛應用于比較作物的親緣關系，有助于改善馴化作物［85］。將已經獲得的結果、同位素試驗和全面的植物測量進一步與轉錄組學研究相結合，可以進一步加深我們對這些關鍵過程的理解。

目前對于植物在脅迫下的應答機制的認識還十分有限。未來試驗的設計可以采用多學科的方法，將不同組學技術整合到一起，將分子信息與植物表征變化聯系到一起，可以在一定程度上揭示植物的抗逆綜合生化網絡，進而應用到基因工程中，為植物抗逆境基因的挖掘提供理論依據，增強經濟作物對各種非生物脅迫的耐受性，同時對糧食作物的食品安全也有重要意義。