溫度對克氏原螯蝦腸道菌群結構的影響

王飛飛　王夏雯　金倩　張智慧　王澤平　田勝營　王信海

摘要： 采用高通量測序技術，利用16S rRNA序列信息，研究了不同養殖溫度條件下克氏原螯蝦腸道菌群的多樣性。測序結果顯示：15 ℃、19 ℃、23 ℃、27 ℃、31 ℃養殖水溫下，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門為腸道主要菌門，叢毛單菌屬和鞘脂單胞菌屬為主要菌屬。養殖水溫不同，腸道優勢菌群所占比例不同，叢毛單菌屬在水溫 15 ℃處理組占比最高，鞘脂單胞菌屬19 ℃處理組占比最高。Alpha多樣性分析結果顯示， 23 ℃處理組克氏原螯蝦腸道菌群Simpson指數和Shannon指數顯著高于15 ℃、19 ℃、27 ℃處理組（P<0.05），23 ℃處理組檸檬酸桿菌和氣單胞菌豐度較高，是其特有菌屬，也是蝦類主要致病菌。試驗結果初步顯示，溫度是影響克氏原螯蝦腸道菌群結構進而導致病害發生的重要因素之一。

關鍵詞： 克氏原螯蝦;腸道菌群;溫度;高通量測序

中圖分類號： S966.12 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2022）01-0157-08

Abstract： Using high-throughput sequencing technology and 16S rRNA sequence information， the intestinal flora diversity of Procambarus clarkii under different temperatures was studied. The sequencing results showed that Proteobacteria， Bacteroidetes and Firmicutes were the dominant flora at the phylum level at 15 ℃，19 ℃，23 ℃， 27 ℃and 31 ℃， Curvibacter and Sphingomonas were the dominant genera at the genus level. The proportion of these dominant intestinal flora was different with different temperatures. Curvibacter had the largest proportion in 15 ℃ group，and Sphingomonas had the largest proportion in 19 ℃ group. Alpha diversity analysis results indicated that Simpson index and Shannon index in 23 ℃ group were significantly higher than those in 15 ℃， 19 ℃， 27 ℃ groups （P<0.05）. Particular bacteria in the 23 ℃ group were Aeromonas and Citrobacter， which were also the main pathogenic bacteria of shrimp. The above research results preliminarily explain the effects of temperature on the microbial community and disease outbreak of Procambarus clarkii.

Key words： Procambarus clarkii;gut microbiota;temperature;high-throughput sequencing

克氏原螯蝦 （Procambarus clarkii） ，屬于節肢動物門（Arthropoda）甲殼綱（Crustacea），俗稱小龍蝦，近年來已成為中國重要的養殖水產品。2018年中國克氏原螯蝦養殖面積超過1.10×106 hm2，出口超過1.00×106 t[1]。養殖規模不斷提高的同時，病害問題也日益突出，導致養殖效益大幅下降，環境污染時有發生，克氏原螯蝦的質量安全也受到較大的影響，產業的可持續發展受到挑戰。研究結果表明細菌感染是導致克氏原螯蝦死亡的重要原因，腸道菌群與克氏原螯蝦健康息息相關，保持腸道菌群的動態平衡有助于抵抗病原體侵入，有效預防病害發生[2]。

水產品腸道菌群動態平衡與溫度有著密切的聯系。全紫嬌等[3]研究發現，隨著水溫的改變，刺參腸道菌群結構變化顯著。Liu等[4]研究發現秋季克氏原螯蝦腸道菌群多樣性和豐度高于夏季。有研究者認為克氏原螯蝦病害集中爆發的“五月瘟”是由于水溫的變化引起克氏原螯蝦腸道菌群失衡而導致的[5]。養殖水溫與克氏原螯蝦腸道菌群多樣性之間有何聯系，水溫變化與克氏原螯蝦疾病爆發有何關聯，目前尚未見到相關報道，克氏原螯蝦腸道菌群結構與溫度關系缺乏系統性的研究。

本研究對不同溫度下克氏原螯蝦腸道細菌微生物16S rRNA基因序列進行測定，以期找出養殖水溫與克氏原螯蝦腸道細菌菌群結構及多樣性之間的內在聯系，明確易致病細菌菌群隨溫度變化規律，為克氏原螯蝦疾病預防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗開始于2020年3月20日，克氏原螯蝦來自宿豫玲瓏水產公司養殖基地，捕撈后置于充氧水箱中，30 min內運至實驗室，暫養7 d，水溫設置在15 ℃左右。然后從中選擇活力強、大小均勻的克氏原螯蝦用于試驗。試驗設5個溫度梯度，依次為15 ℃、19 ℃、23 ℃、27 ℃、31 ℃，每組3次重復，試驗水箱容量20 L，均裝有控溫電熱棒，箱內放置10 cm 長的 PVC 管作為克氏原螯蝦躲避物，每個水箱放幼蝦15尾，規格為每尾1 g左右，共計225尾。水溫初始均為15 ℃，然后以0.5 ℃/h逐漸升溫至試驗溫度。試驗期間，每天吸污、換水各1次，換水量約為原水量的20%，換水溫度與試驗溫度一致。養殖時間為21 d，其間，每天上午、下午各喂料1次，投喂量為蝦總質量的3%～4%。

1.2 樣品制備

試驗達到養殖天數后，停止喂料24 h，從每個水箱隨機取5只克氏原螯蝦，在無菌環境下，取出腸道內容物并充分混合后，置于無菌離心管，作為一個樣品處理。共獲得樣品15個，每個樣品在處理完成后，立即放入準備好的干冰盒中，送至鑫普華生物公司進行處理及測序，處理方法參照文獻[6]中的方法進行，16S rRNA測序在Illumina MiSeq PE300平臺完成。

1.3 數據處理

測序后，用Pandaseq軟件、PRINSEQ軟件、Usearch軟件分別進行序列拼接、質控處理及去除嵌合體，選擇Silva數據庫進行比對。

1.4 統計分析方法

使用Excel 對數據進行處理，數值采用平均值±標準差。利用SPSS 18.0軟件分析數據，利用R語言制作相關圖形。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下克氏原螯蝦腸道菌群測序結果

測序結果（表1）顯示，不同溫度處理組15個樣品共計獲得有效序列1 920 880條，平均128 058.6條，有效序列占比均超過80%，符合分析要求。為了保證分析結果合理，各樣品統一按照最低樣本數量（62 607）進行分析，一致性97%以上的序列作為同一個分類操作單位OTU（Operational taxonomic units）處理，15個樣品共計聚類8 216個OTU。測序深度99.05%～99.46%，測序效果良好。Alpha多樣性分析結果（表2）顯示，31 ℃組中，Chao1指數顯著高于其他4組（P<0.05），Observed-sopecies指數顯著高于15 ℃、19 ℃、27 ℃處理組，表明溫度在31 ℃時克氏原螯蝦腸道菌群的豐富度比其他養殖溫度腸道菌群高，Simpson指數和Shannon指數在23 ℃處理組顯著高于15 ℃、19 ℃、27 ℃處理組，表明該溫度下腸道菌群的多樣性比其他養殖溫度高。

2.2 不同養殖溫度下克氏原螯蝦腸道菌群組成分析

在門分類水平上，選取豐度靠前的20個物種進行分析（圖1），發現變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（ Bacteroidetes） 和厚壁菌門（Firmicutes）是各溫度組克氏原螯蝦腸道的主要菌群。其中變形菌門占比均超過50%，在15 ℃、19 ℃處理組所占比例超過90%，在23 ℃處理組占比最低（52.6%）。擬桿菌門在27 ℃處理組占比例最大（5.6%），15 ℃處理組占比最低（0.9%）。厚壁菌門在23 ℃處理組占比例較大（8.7%），15 ℃處理組占比最小（1.1%）。

在屬分類水平上（圖2），叢毛單菌屬（Curvibacter）是15 ℃、27 ℃和31 ℃處理組的優勢菌屬，不同溫度下各處理組所占比重差別較大，15 ℃處理組所占比例最大（68.2%），23 ℃處理組所占比例最少（3.1%）。鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）受溫度影響也較大，在15 ℃、19 ℃、31 ℃處理組占比較大，其中19 ℃處理組占比最大（36.8%）;在23 ℃、27 ℃處理組占比較小，其中23 ℃處理組占比最少（1.3%）。氣單胞菌屬（Aeromonas）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter）在23 ℃處理組占比分別為11.2%、7.7%，在其他處理組別中占比較少。

物種熱圖更加直觀顯示不同樣品優勢菌群之間的差異。由圖3可知，變形菌門是各組的優勢菌群，23 ℃、27 ℃、31 ℃處理組主要菌群豐度較高。由圖4可知，在屬水平上，23 ℃處理組菌群結構與其他組有較大差異，優勢菌群不同于其他處理組。叢毛單菌屬、鞘脂單胞菌屬是15 ℃、19 ℃、27 ℃、31 ℃處理組優勢菌群。

2.3 不同溫度下克氏原螯蝦腸道菌群相似性分析

根據OTU聚類分析結果，構建韋恩圖（圖5）。圖5直觀展示了各組OTU數目組成的特有性與相似性，5個樣品共有875個OTU，占總數8.5%。說明克氏原螯蝦腸道菌群受溫度影響較大，15～31 ℃獨有的OUT數量分別為212、374、617、225、915。31 ℃處理組獨有的OUT最多，說明31 ℃處理組克氏原螯蝦腸道菌群最復雜。

主坐標分析結果（圖6）顯示，同一處理均落在相同區域，說明樣品具有較好的重復性;15 ℃、27 ℃處理組呈現區域性聚集，19 ℃、23 ℃、31 ℃處理組呈現區域性聚集，說明腸道菌群受溫度影響較大。

3 討論

3.1 溫度對克氏原螯蝦腸道菌群多樣性的影響

采用高通量測序技術對不同溫度條件下克氏原螯蝦腸道樣品進行測序，5個樣品共獲得克氏原螯蝦腸道細菌菌群33門、60綱、140目、265科、955屬，測序深度達到99%以上，其結果可以有效反映出克氏原螯蝦腸道細菌菌群組成。水產品腸道微生物菌群多樣性受溫度影響較大，如吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）腸道菌群在水溫22 ℃和28 ℃時豐度顯著高于其他溫度[7]。Sha等[8]研究發現水溫為14 ℃時不同規格的養殖海參（Apostichopus japonicus）腸道組織中均檢測不到弧菌屬（Vibrio），而其他溫度下存在弧菌屬，說明養殖海參腸道內弧菌菌群與養殖溫度息息相關。溫度也是影響水產品養殖水體生物菌群多樣性重要因素，如擬穴青蟹（Scylla paramamosain）養殖水溫過高或過低均會導致水體菌群豐度和多樣性顯著減小[9]。本研究結果顯示，蝦腸道菌群多樣性在23 ℃時最高，31 ℃時腸道菌群的豐富度最高。

3.2 基于門水平的不同溫度克氏原螯蝦菌群組成分析

由聚類分析結果可知，變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是克氏原螯蝦腸道主要菌群。這與陳一鳴等[10]、Liu等[4]研究結果一致，但本研究中變形菌門占比較大，優勢明顯，其余門類占比較小，推測可能與養殖環境有關。變形菌門是水產動物如大黃魚（Larimichthys crocea）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei ）等[11-13]腸道中的優勢菌群。本研究結果顯示克氏原螯蝦腸道中變形菌門豐度隨著溫度升高表現為先下降后上升的趨勢，在23 ℃時菌群豐度最低。研究者認為甲殼動物腸道變形菌門比例升高會增加爆發疾病的風險，中華絨螯蟹、凡納濱對蝦等[14-15]感染白斑綜合征（WSSV）后變形菌門相對豐度會明顯上升，但陳一鳴等[10]研究發現克氏原螯蝦患病前后變形菌門相對豐度未見顯著變化。本試驗養殖期間未發現克氏原螯蝦患病，因此不能推斷變形菌門豐度變化與克氏原螯蝦患病之間的聯系。研究結果表明擬桿菌門豐度與碳水化合物代謝呈正相關關系，厚壁菌門豐度與營養轉運相關呈正相關關系[16]，擬桿菌促進能量代謝，厚壁菌促進營養吸收。本研究中擬桿菌門和厚壁菌門豐度隨著溫度的升高先上升后下降。擬桿菌門和厚壁菌門豐度在23 ℃和27 ℃時較高，說明在23 ℃和27 ℃克氏原螯蝦吸收和代謝水平較其他溫度高。

3.3 基于屬水平的不同溫度克氏原螯蝦腸道菌群組成分析

根據聚類分析結果，不同溫度處理組樣品中均發現叢毛單菌屬和鞘脂單胞菌屬，但其豐度受溫度影響較大。研究發現叢毛單胞菌屬細菌豐度常與水體有機物濃度呈正相關，叢毛單菌屬大部分細菌可分解酚類物質、硝基苯類化合物、銨態氮等物質[17-18]，鞘脂單胞菌屬細菌常被用來降解有機污染物[19]。彭輝輝等[20]研究發現常規稻田水體叢毛單菌屬細菌高于養鯉魚稻田水體，主要是因為常規稻田水體中有機物濃度較高。羅金飛[9]研究發現擬穴青蟹水體中的鞘脂單胞菌屬細菌豐度在22 ℃時最高，且與銨態氮含量呈顯著正相關。本試驗中克氏原螯蝦幼蝦腸道叢毛單菌屬細菌豐度隨溫度的升高表現為先下降后上升的趨勢，在23 ℃時占比最小，且遠低于其他溫度。有研究者認為蝦類自身微生物生態與養殖環境關系密切[21-23]，推測本試驗中23 ℃時有機物濃度較低，導致水體叢毛單菌屬、鞘脂單胞菌屬細菌豐度較低，進而影響克氏原螯蝦腸道中叢毛單菌屬、鞘脂單胞菌屬細菌含量。

本研究發現23 ℃組氣單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬占比較大，在其他處理組中占比較小。氣單胞菌和檸檬酸桿菌是淡水養殖主要致病菌，氣單胞菌感染魚類后容易引發敗血癥、腸炎及皮膚潰爛壞死等癥狀[24-28]。氣單胞菌也是引起蝦類發病的主要病原菌[29]。陳一鳴等[10]研究發現患病克氏原螯蝦腸道氣單胞菌屬細菌豐度顯著高于健康蝦。郁維娜等[30]研究發現感染白斑綜合征病毒的凡納濱對蝦腸道中氣單胞菌屬等菌群數量顯著升高。有研究者認為克氏原螯蝦五月份集中發病的主要原因是由于氣單胞菌等病菌感染所致[31]。本研究中23 ℃處理溫度接近五月份克氏原螯蝦池塘養殖水溫，23 ℃處理組克氏原螯蝦腸道氣單胞菌豐度高于其他溫度處理組，說明溫度可能是影響氣單胞菌豐度的重要因素。目前已有檸檬酸桿菌感染中華鱉（Trionyx sinensis）、棘胸蛙（Quasipaa spinosa）和青魚（Mylopharyngodon piceus）等引發疾病的報道[32-34]。檸檬酸桿菌屬細菌是從爆發疾病的克氏原螯蝦、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）、凡納濱對蝦等蝦蟹品種中分離出來的主要致病菌之一[35-37]。Liu等[4]研究不同季節克氏原螯蝦腸道菌群發現秋季精養池塘中克氏原螯蝦腸道檸檬酸桿菌屬細菌豐度比夏季顯著升高。本研究中23 ℃處理組克氏原螯蝦腸道檸檬酸桿菌豐度遠高于31 ℃處理組，說明溫度可能是影響檸檬酸桿菌屬細菌豐度的重要因素。綜上所述，本試驗結果表明溫度可能是造成克氏原螯蝦腸道氣單胞菌屬和檸檬酸桿菌屬等致病菌增加的主要原因。

本研究初步闡明了水溫對克氏原螯蝦腸道菌群特別是一些致病菌群的影響，下一步將繼續研究不同溫度對克氏原螯蝦機體生理生化指標的影響，進一步探討溫度與克氏原螯蝦疾病爆發之間的理論機制。

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（責任編輯：張震林）

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