Meyerozyma sp.合成Ag2S量子點及其抗菌性*

張小雪，孫維良，張友德，武 超，鄧國志

(1. 安徽大學 資源與環境工程學院，合肥 230601;2. 安徽大學 濕地生態保護與修復安徽省重點實驗室,合肥 230601;3. 安徽新宇生態產業股份有限公司，合肥 230601)

0 引 言

近年來，由細菌引起的問題越來越多，其中病原微生物污染引起的生物危害一直被認為是全球范圍內危害健康的問題[1]，因此抗菌劑及其應用受到了廣泛的關注。常用的抗菌劑有臭氧、次氯酸鹽和抗生素等，但這些抗菌劑往往會造成水資源的二次污染[2]、鹽化以及造成細菌對抗生素產生耐藥性[3]，同時具有高能耗、高運行成本的缺點。因此近些年許多有效的抗菌材料也被開發出來。由于納米材料具有尺寸小，比表面積大，以及更高的活性等優異特性，因此展現出極大的潛力和廣泛的應用前景。其中量子點是一種具有獨特光學性質且性能穩定的半導體納米材料[4]。銀基納米材料具有極其優異的殺菌潛力[5]。因此，在環境凈化中得到了廣泛的應用。最近的研究報告了 Ag2S納米粒子對不同類型的耐藥細菌(革蘭氏陽性和革蘭陰性菌)的抑制作用[6-7]。

硫化銀(Ag2S)是一種帶隙約為(0.9～1.05 eV)半導體材料[8]，Ksp=6.3×10-50[9]，超低的溶度積常數使進入生物體系中的銀離子的最小釋放量遠小于生物醫學研究領域中廣泛使用的鎘源量子點[10]。硫化銀(Ag2S)量子點的合成方法有物理法、化學法，包括水熱合成法、微波加熱法等[8]。Brelle等人在1999年首先報道了通過半胱氨酸和谷胱甘肽修飾合成直徑約為9 nm的硫化銀納米粒子[11]。2004年有研究者通過十二烷基硫醇和硫代乙酰胺制備單分散的硫化銀納米粒子[12]。2004年，Ikushima 等合成平均粒徑約5.9 nm的Ag2S納米晶，首次以 Ag2S QDs 命名[13]。真菌是公認的合成金屬納米顆粒的生物對象，因為真菌能夠分泌出大量的酶，并且容易控制合成過程[14-15]。因此通過微生物綠色合成硫化銀(Ag2S)納米粒子越來越重要。

本文主要研究真菌生物合成硫化銀(Ag2S)量子點并揭示其可能存在的抗菌性。用硝酸銀作為銀源，用亞硫酸鈉作為硫源，在酸性條件下通過酵母菌合成Ag2S納米粒子。通過倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)和X射線光電子能譜(XPS)，確定了Ag2S QDs 的合成。此外，通過生物合成的Ag2S QDs研究對革蘭陰性菌(大腸桿菌、銅綠假單胞菌)和革蘭氏陽性菌(芽孢桿菌)的抗菌性。研究結果為制備Ag2S QDs提供了一條簡單、環保、經濟的途徑。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

1.1.1 培養基

LB培養基：5 g/L yeast extract，10 g/L tryptone，5 g/L NaCl，121 ℃ 滅菌 20 min。

R2A培養基：0.5 g/L Tryptone，0.5 g/L酪蛋白氨基酸、0.5 g/L可溶性淀粉、0.5 g/L Yeast Extract、0.05 g/L MgSO4·7H2O、11.80 g/L檸檬酸、13.42 g/L K2HPO4、1.5 mmol/L丙酮酸鈉、10 g/L D-glucose，121 ℃滅菌 20 min。

1.1.2 儀 器

全自動冷凍研磨儀，PowerDry LL3000；高速冷凍離心機，美國 SCILOGEX公司；恒溫氣浴振蕩培養箱，常州國華儀器公司；X 射線光電子能譜儀，美國 ESCALAB 250Xi；X 射線衍射儀，日本 SmartLab 9 kW；掃描電鏡 REGULUS8230；倒置熒光顯微鏡 ScopeA1 ZEISS 德國；液相色譜-質譜聯用儀，美國 LTQ Orbitrap XL；紫外-可見光譜儀，美譜達UV-1100。

1.2 菌株的培養

本研究中使用的菌株是從大慶油田土壤中獲得。

在無菌操作臺挑取Meyerozymasp.菌，轉入含有500 μL R2A培養基的1.5 mL EP管中，放入30 ℃ 、150 r/min搖床中培養12 h轉入含有50 mL LB的250 mL錐形瓶中，放入30 ℃、 150 r/min搖床中培養24 h ，如圖1(c)所示，為顯微鏡下觀察到的Meyerozymasp.菌，形態近似球形。

1.3 Ag2S納米粒子的合成

將Meyerozymasp.菌戳入含有 500 μL R2A培養基后，放入搖床，30 ℃ 、150 r/min，培養12 h，再將500 μL菌液加至含有50 mL R2A培養基的250 mL形瓶中并加入90 μL 50%葡萄糖和50 μL 1.5 mmol/L丙酮酸鈉作為碳源，放入搖床，30 ℃、150 r/min，培養24 h；向錐形瓶中加入1 mmol/L AgNO3和1 mmol/L Na2SO3,放入搖床，30 ℃ 、150 r/min，培養48 h,溶液顏色變為淺褐色。通過高速冷凍離心機8 000 r/min、5 min離心；將離心后的上清液倒出，加入純水進行沖洗兩次，將上清液倒出。沉淀用純水重懸后于全自動冷凍研磨儀破碎細胞，8 000 g/min、10 min離心，上清液用1kD透析袋透析后，用0.22 μm濾頭過濾，得到純化后的Ag2S。

1.4 Ag2S納米粒子的材料分析方法

取20 μL合成48 h 后Ag2S樣品于玻片上，通過倒置熒光顯微鏡觀察發光情況；取合成48 h后Ag2S樣品 2 mL 離心(1 000 r/min、10 min)棄上清液，用戊二醛和乙醇處理，再利用掃描電鏡(SEM)觀察粒子形貌；冷凍干燥后的粉末用X射線光電子能譜(XPS)分析確定合成的Ag2S納米材料的元素組成和價態；X射線衍射儀(XRD)測定合成樣品的晶型。樣品離心后的上清在190～700 nm范圍內利用紫外-可見光譜儀(UV-Vis)全波長掃描。

1.5 Ag2S納米粒子的抗菌性

E.coli、Pseudomonasaeruginosa、Bacillus轉接入500 μL LB 培養基后，放入搖床，30 ℃ 、150 r/min，培養12 h；將OD600=0.5的菌液用涂布棒均勻地涂抹在LB平板上，放入直徑為5 mm濾紙片，將不同濃度的Ag2S納米材料加入到濾紙片中觀察抑菌圈大小并測量其直徑；通過滴板殺菌研究Ag2S QDs對OD600=0.2的E.coli、Pseudomonasaeruginosa、Bacillus的抗菌活性。

抗菌率=[(A-B)/A]×100

式中：A為對照組平均菌落數；B為實驗組組平均菌落數[16]。

2 結果與討論

2.1 Ag2S QDs的合成及表征

在含有Meyerozymasp.的R2A培養基中加入1 mmol/L AgNO3和1 mmol/L Na2SO3培養48 h后,如圖1(a)和(b)所示，培養基顏色發生變化推測Ag2S QDs的合成。取10 μL菌液滴入到玻片上制樣，玻片倒置放在載物臺上，倒置熒光顯微鏡觀察，如圖3(a)、(b)和(c)所示。圖3(a)為在明亮背景中的成像，圖3(b)為在明亮背景中，在40倍鏡下，用紫外熒光激發塊激發，可以觀察到部分菌體出現熒光，圖3(c)為關閉房間內的電燈和倒置熒光顯微鏡的白光下的成像，推測有Ag2S QDs的合成。

圖1 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDsFig 1 Biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

圖2 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的UV-Vis圖Fig 2 UV-Vis of the synthesized Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.1.1 紫外-可見光光譜(UV-Vis)分析

金屬納米粒子在UV-Vis上的表面等離子體共振吸收峰的峰位和峰形狀受納米粒子的尺寸、分布范圍以及環境等方面因素的影響[17]。合成樣品通過紫外可見光譜分析，以純水為空白樣作基線，將樣品稀釋后加入到比色皿中進行全波長掃描，Uv-vis結果顯示，如圖2所示，在410 nm處出現表面等離子體共振吸收峰，表明Ag2S QDs的合成。已有文獻證實[18]。同時該表面等離子體共振激子峰的半高寬比較大，表明合成納米粒子的尺寸分布范圍較廣[19]。

2.1.2 掃描電鏡SEM分析

如圖4所示，為反應后樣品的掃描電鏡(SEM)，圖4(a)為帶有菌體和材料的樣品，可以觀察到納米粒子附著在細胞表面，近似球形的Meyerozymasp.細胞發生輕微變形，表明了Ag2S QDs在細胞表面合成。圖4(b)為合成Ag2S QDs的掃描電鏡(SEM)，觀察到合成納米粒子為球形，出現團聚現象。

圖3 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs 倒置熒光顯微鏡圖(×40)Fig 3 The inverted fluorescence microscopy of the biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp. (×40)

圖4 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs 掃描電鏡(SEM)Fig 4 SEM of the biosynthesis of Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.1.3 XRD、XPS分析

通過X射線衍射圖譜確定合成的Ag2S QDs的晶型。如圖5(a)所示由Meyerozyma sp.嘗試合成的Ag2S QDs X射線衍射圖譜與對照。樣品在26.3°、28.9°、31.5°、46.2°、54.1°、57.1°、67.9°出現明顯的衍射峰，與標準PDF(14-0072)卡片中( 1 1 0) ，( -1 1 2) ，(-1 2 3)，( 0 4 1) ，(1 1 4)， (2 3 2)晶面衍射峰對應,確定其晶型為單斜α-Ag2S。根據XPS圖譜分析Meyerozymasp.合成Ag2S QDs的元素價態，如圖5(b)、(c)和(d)所示，通過XPS圖譜可以確定合成納米材料包含C、N、O、Ag、S元素。對于Ag 3d在373.9和368 eV處大的峰相對應于Ag3d 3/2和Ag3d 5/2，表明了Ag+的存在[20]。對于S 2p在163.7和161.9 eV處的峰相對應于S 2p 和S 2p 1/2，表明了S2-的存在，結果與NIST XPS數據庫相對應。進一步證明了Ag2S QDs的合成。

圖5 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的X射線衍射圖譜和XPS圖譜Fig 5 XRD and XPS patterns of the synthesized Ag2S QDs by Meyerozyma sp.

2.2 Ag2S QDs抗菌性測試

2.2.1 紙片擴散法

通過紙片擴散法，測試Meyerozymasp.合成Ag2S QDs對革蘭陰性菌和革蘭氏陽性菌的抗菌性。如圖6和表1所示，隨著加入Ag2S QDs的濃度從10 mg/L增加到50 mg/L，抑菌圈的直徑逐漸增大。表明隨著抗菌材料濃度的增加，抗菌效果越好，其中大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌圈比芽孢桿菌的抑菌圈直徑大，表明Ag2S QDs對革蘭陰性菌的抗菌性更強。這可能與細菌獨特的結構有關，革蘭氏陽性菌的肽聚糖層一般較革蘭陰性菌厚，由于金屬納米顆粒難以穿透細胞細菌胞質[21]，從而使其對金屬抗菌劑的敏感性降低。

2.2.2 滴板殺菌

通過96孔板測定Ag2S QDs對細菌的最小抑制濃度(MIC)為7.5 mg/L使用滴板殺菌的方式測定Ag2S QDs對致病菌的抗菌率。如圖6(b)、(c)和(d)所示，Ag2S QDs濃度為7.5 mg/L時，在2 h內對OD600=0.2的大腸桿菌、芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌性測試。圖6(b)對銅綠假單胞菌的抗菌率在10 min時約為98%，30 min時抗菌率達到100%。圖6(c)對芽孢桿菌在2 h內抗菌率約為99.9%。圖6(d)對大腸桿菌10 min時抗菌率達到90%，30 min時抗菌率為99.99%，90 min時抗菌率可達到100%。

表1 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的抑菌圈直徑

圖6 Meyerozyma sp.合成Ag2S QDs的抑菌圈及抗菌性Fig 6 Inhibition zone and antimicrobial activity of Ag2S QDs synthesized by Meyerozyma sp.

2.2.3 Ag2S QDs抗菌機理

通過掃描電鏡SEM分析Ag2S QDs的抗菌機理。有研究表明其殺菌效果可能與納米粒子表面自由基的形成有關。這些自由基與細菌膜脂相互作用，導致膜功能受損[8]。如圖7所示，圖7(a)、(b)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的銅綠假單胞菌，可以清晰地觀察到，銅綠假單胞菌的細胞為桿狀，處理前表面光滑，無褶皺。經過Ag2S QDs處理后，銅綠假單胞菌的細胞表面出現褶皺。圖7(c)、(d)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的芽孢桿菌，形狀為桿狀。處理前芽孢桿菌細胞完整，Ag2S QDs處理后，芽孢桿菌的細胞表面輕微變形。圖7(e)、(f)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的大腸桿菌，形狀為桿狀。處理前大腸桿菌細胞完整且表面光滑，Ag2S QDs處理后，大腸桿菌的細胞表面出現明顯破損、凹陷、變形，與報道相似[22-23]。通過SEM掃描電鏡分析，推測Ag2S QDs對細菌細胞的作用可能是吸附在細胞表面后使細胞膜發生破損，同時小粒徑的Ag2S QDs可能穿透細菌膜，破壞DNA和蛋白質，從而對細胞造成損壞，進而導致了細胞死亡[24]。

圖7 掃描電鏡圖：(a)、(b)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的銅綠假單胞菌；(c)、(d)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的芽孢桿菌；(e)、(f)分別為未處理和Ag2S QDs處理后的大腸桿菌Fig 7 Scanning electron microscopy

3 結 論

利用從大慶油田土壤中篩出的耐重金屬真菌，季也蒙畢赤酵母Meyerozymasp.，還原硝酸銀和亞硫酸鈉合成具有單斜α-Ag2S晶型硫化銀(Ag2S)量子點，并借助X射線光電子能譜分析(XPS)、X射線衍射(XRD)、倒置熒光顯微鏡、掃描電鏡等手段對合成的硫化銀(Ag2S)量子點進行表征，同時通過紙片擴散法和滴板殺菌研究了合成的硫化銀(Ag2S)量子點的抗菌性。得到的結果表明，通過Meyerozymasp.菌合成納米粒子，對革蘭陰性菌包括Escherichiacoli和Pseudomonasaeruginosa以及革蘭氏陽性菌Bacillus均有顯著的抗菌性，并隨著材料濃度的增加，抗菌性逐漸增強。對銅綠假單胞菌、大腸桿菌分別在30和90 min時抗菌率達到100%，對芽孢桿菌在2 h內抗菌率約為99.9%。根據對處理后的Escherichiacoli、Pseudomonasaeruginosa和Bacillus的掃描電鏡分析，推測造成細菌死亡的原因可能是由于Ag2S吸附在細菌細胞膜表面，造成膜的損傷，進而導致細胞死亡。研究為硫化銀(Ag2S)量子點的合成提供了一條簡單環保的途徑，由于其熒光和抗菌特性，可用于熒光探針及抗菌劑等方面的應用。