多肽K-YFAE對H9C2心肌細(xì)胞增殖及缺氧耐受的影響

王靠山,朱 莉

(揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,中國江蘇 揚州 225008)

心肌梗死中,缺氧、缺血等多種因素常導(dǎo)致心肌發(fā)生壞死,而目前尚無治療方法可以逆轉(zhuǎn)這種壞死[1],故心臟再生越來越引起人們的關(guān)注。成熟的心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,通常被認(rèn)為幾乎沒有再生能力,但越來越多的實驗研究表明,在某些特定情況下,心肌細(xì)胞是可以再生的,如:美國有學(xué)者發(fā)現(xiàn)新生小鼠在出生后的7 d內(nèi),其心肌細(xì)胞是可以再生的,這一特定時間段被稱為心臟再生的窗口期,只是這種再生能力隨后又失去了[2]。多肽是由多個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物,機體的眾多活性物質(zhì)都是以多肽的形式存在。近年來,多肽以毒性低、特異性高、相對分子質(zhì)量小等獨特優(yōu)勢被廣泛研究于組織再生領(lǐng)域[3],如:Stiernberg等[4]研究發(fā)現(xiàn),合成肽(TP508)能促進肢體損傷血管的再生,加速皮膚傷口的愈合。

近期,筆者所在課題組在乳鼠心臟再生相關(guān)多肽的篩選項目中開展了與心臟再生相關(guān)多肽的篩選工作。以出生后1 d的乳鼠心臟組織樣本為檢測對象、出生7 d后的小鼠心臟組織標(biāo)本為對照,應(yīng)用Nano LC-MS/MS(nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry)質(zhì)譜技術(shù)篩選與心臟再生相關(guān)的多肽,結(jié)果發(fā)現(xiàn)出生后1 d與7 d的小鼠心臟多肽的表達(dá)存在較大差異。在出生后1 d的小鼠心臟組織中,差異高表達(dá)2倍以上的多肽有73條,差異低表達(dá)2倍以上的多肽有36條。其中,一條前體蛋白為富含半胱氨酸腸蛋白2(cysteine-rich intestinal protein 2,Crip2)的多肽 KTVYFAE(文中簡稱“K-YFAE”),在出生后1 d與7 d的小鼠心臟組織中的差異表達(dá)倍數(shù)高達(dá)2.82倍,且表現(xiàn)為下調(diào),其生物信息學(xué)分析顯示,K-YFAE全長7個氨基酸,相對分子質(zhì)量為856.97,等電位點為6.0,是一條疏水性多肽,在體內(nèi)、體外都非常穩(wěn)定。肽學(xué)研究早已發(fā)現(xiàn)多肽可能與其前體蛋白發(fā)揮相似的作用。而Crip2蛋白作為LIM蛋白家族的重要成員之一,在心臟發(fā)育、細(xì)胞免疫等過程中發(fā)揮重要作用[5]。故本文擬觀察多肽K-YFAE對H9C2心肌細(xì)胞增殖及缺氧耐受的影響,為心臟再生提供新的研究對象,促進心臟再生機制的理解,為心肌梗死提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠心肌細(xì)胞H9C2、DMEM完全培養(yǎng)基、細(xì)胞增殖及毒性檢測(CCK-8)試劑盒均購自江蘇無錫懷信公司,多肽K-YFAE由上海科肽公司合成,qPCR試劑盒及流式凋亡試劑盒購自諾唯贊公司(中國),無菌操作臺和培養(yǎng)箱購自ThermoFisher公司(美國),倒置相差顯微鏡購自Nikon公司(日本),純水儀購自Millipore公司(美國),qPCR儀購自Analytik Jena公司(德國),流式細(xì)胞儀購自Beckman公司(美國),其余基礎(chǔ)實驗室試劑如磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)、無水乙醇等均由泰州市人民醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

H9C2心肌細(xì)胞使用10 mL DMEM完全培養(yǎng)基于37℃溫箱中靜置培養(yǎng),每2～3 d換液1次。將生長到對數(shù)期的細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板上,細(xì)胞密度為每孔1×105個,然后分組處理。

1.3 實驗分組

培養(yǎng)后的H9C2心肌細(xì)胞分為對照組、多肽處理組。其中多肽組分為3個濃度,分別為10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L,對照組只使用 10%的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)處理。所有組均為每2 d換液1次。

1.4 多肽K-YFAE對H9C2心肌細(xì)胞增殖的影響

分組、干預(yù)7 d后,對各組細(xì)胞分別行CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、qPCR反應(yīng)檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因等實驗。

1.4.1 CCK-8細(xì)胞增殖檢測

將各組細(xì)胞分別消化后制成細(xì)胞懸浮液并均勻鋪入96孔板中,按照CCK-8試劑盒說明書步驟檢測OD值。

1.4.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

將原培養(yǎng)液、PBS以及消化后的細(xì)胞懸液一起收集于EP管中,1 000 r/min離心5 min。棄上清,加入1.5 mL預(yù)冷的PBS,1 000 r/min離心5 min后去除PBS和細(xì)胞碎片。加入1.5 mL預(yù)冷的PBS,在渦旋狀態(tài)下加入無水乙醇3.5 mL,4℃固定30 min后1 000 r/min離心5 min,將乙醇吸除,加PBS清洗混勻。1 000 r/min離心5 min后,將殘留的乙醇除去并吸除管內(nèi)PBS,然后加入200 μL PBS和2 μL RNA酶,37℃下孵育30 min。加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)于室溫下避光染色30 min,將EP管內(nèi)細(xì)胞過濾至含有PBS的EP管中,檢測細(xì)胞周期。

1.5 多肽K-YFAE對H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響

采用三氣培養(yǎng)箱使細(xì)胞暴露于缺氧環(huán)境3 h,然后分組,24 h后觀察細(xì)胞形態(tài),并對各組細(xì)胞分別行TUNEL檢測細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡、qPCR反應(yīng)檢測細(xì)胞凋亡周期相關(guān)基因等實驗。

1.5.1 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡

在室溫下將約5×107mL-1H9C2心肌細(xì)胞固定于4%中性甲醛中10 min。在載玻片上滴加細(xì)胞懸液50～100 μL,干燥后用PBS清洗5 min,共清洗兩次。室溫下,在色缸中加入含2%過氧化氫的PBS,反應(yīng)5 min后再次用PBS洗兩次,每次5 min。吸去載玻片上多余液體后,在切片上加兩滴TdT酶緩沖液,室溫下靜置5 min。再次吸去多余液體后滴加TdT酶反應(yīng)液54 μL,37℃下在濕盒中反應(yīng)1 h。在染色缸中加入預(yù)熱至37℃的洗滌和終止反應(yīng)緩沖液,37℃下保溫30 min,每10 min輕輕攪動1次。用PBS洗3次切片,每次5 min,滴加過氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體兩滴,室溫下,于濕盒中反應(yīng)30 min,PBS清洗4次,每次5 min。在切片上加入現(xiàn)配的0.05%DAB溶液,室溫顯色5 min后蒸餾水清洗4次,前3次每次1 min,最后1次5 min。甲基綠復(fù)染10 min后蒸餾水洗3次,前兩次提起放下載玻片10次,最后靜置30 s,1次。依此法再用100%正丁醇洗3次、二甲苯脫水3次,每次2 min,封片、干燥后,觀察并記錄實驗結(jié)果。

1.5.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

選擇對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的細(xì)胞,消化、洗滌并重懸細(xì)胞后行細(xì)胞染色,加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液,吹勻后,室溫下避光孵育20 min。加入400 μL緩沖液,輕輕混勻,染色后樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 qPCR反應(yīng)檢測細(xì)胞周期及凋亡相關(guān)基因

按照Trizol試劑說明書提取、分離RNA,并測其濃度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后,按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix說明書行qPCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參,采用ΔΔCt法定量分析細(xì)胞周期相關(guān)基因(P21、PLK3、E2F1、cyclin C)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2)的表達(dá)水平。qPCR反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃,30 s;變性95℃,8 s;退火/延伸60℃,8 s;熔解曲線分析95℃,15 s;60℃,60s;95℃,15s。其中,變性與退火/延伸循環(huán)次數(shù)為39次。引物信息如下,P21-FP:5′-AAGACCATGTGGACCTGTCA-3′,P21-RP:5′-GGCTTCCTCTTGGAGAAGAT-3′;PLK3-FP:5′-TCAGCAAGTGGGTTGACTAC-3′,PLK3-RP:5′-GATCTCCACCCTTCATGAGGT-3′;E2F1-FP:5′-CTCGACTACCACTTCGGCCTC-3′,E2F1-RP:5′-TAGAAGCTTCTGGAGACAGAG-3′;cyclin C-FP:5′-GAGCCTCTCGCTGACCAGCT-3′,cyclin C-RP:5′-TGGGCTCTAAATTGGCTCAC-3′;Bax-FP:5′-GATGCGTCCACCAAGAAGCT-3′,Bax-RP:5′-AGCACCAGTTTGCTGGCAAAG-3′;Bcl-2-FP:5′-TGGTATTCAGGATTACATGCATG-3′,Bcl-2-RP:5′-TCAGGAAGACCCTGAAGGAC-3′;GAPDH-FP:5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3′,GAPDH-RP:5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3′。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0進行統(tǒng)計分析。計量資料采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sx)表示,組間比較采用Student’s t-test,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多肽K-YFAE促進H9C2心肌細(xì)胞增殖

顯微觀察結(jié)果顯示,與對照組(control)相比,多肽組H9C2心肌細(xì)胞的密度明顯增加,且隨著多肽濃度的增加,細(xì)胞密度進一步增加(圖1)。在CCK-8檢測細(xì)胞增殖實驗中,多肽K-YFAE的干預(yù)顯著提高了各濃度實驗組心肌細(xì)胞的OD值,并隨著多肽K-YFAE濃度的增加,OD值亦逐漸增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2);在細(xì)胞周期檢測中,多肽組H9C2心肌細(xì)胞的G0/G1周期較對照組明顯縮短,且隨著多肽濃度增加,G0/G1周期進一步縮短(P<0.05),表明多肽K-YFAE能促進H9C2心肌細(xì)胞更早進入分裂期(圖3)。進一步采用qPCR反應(yīng)檢測細(xì)胞周期相關(guān)基因(P21、PLK3、E2F1、cyclin C)的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與對照組相比,P21基因的表達(dá)隨多肽劑量增加而降低,而PLK3、cyclin C、E2F1基因的表達(dá)隨多肽劑量增加而遞增(圖4)。以上結(jié)果均提示,多肽KYFAE可以促進H9C2心肌細(xì)胞增殖,并使得更多細(xì)胞進入分裂期。

圖1 培養(yǎng)7 d后各組H9C2心肌細(xì)胞的形態(tài)標(biāo)尺:100 μm。Fig.1 Morphology of H9C2 cardiomyocytes in each group after cultured for 7 days Scale bar:100 μm.

圖2 CCK-8檢測H9C2心肌細(xì)胞增殖與對照組比較,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001。圖4、6、8、9的統(tǒng)計分析同此圖。Fig.2 Determination of proliferation of H9C2 cardiomyocytes by CCK-8Compared with the control group,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001.The marks have the same meanings in Figs.4,6,8 and 9.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2心肌細(xì)胞增殖Fig.3 Detection of H9C2 cardiomyocyte proliferation by flow cytometry

圖4 細(xì)胞周期相關(guān)基因的qPCR檢測Fig.4 Detection of cell cycle-related genes by qPCR

2.2 多肽K-YFAE促進H9C2心肌細(xì)胞缺氧耐受

通過在顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài),我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過缺氧處理后,對照組細(xì)胞皺縮,而多肽KYFAE處理組細(xì)胞隨多肽劑量增加回復(fù)正常形態(tài)的細(xì)胞數(shù)增多(圖5)。TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,經(jīng)過多肽K-YFAE處理后,與對照組相比,多肽組細(xì)胞凋亡比例減少,且隨著多肽濃度增加,細(xì)胞凋亡比例進一步減少,差異具有顯著性(P<0.01)(圖6)。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,多肽組細(xì)胞更能耐受缺氧,細(xì)胞凋亡率明顯下降(圖7～8)。其中,對照組早期凋亡率(Q1-LR)=10.50%,晚期凋亡率(Q1-UR)=25.23%;20 μmol/L多肽組 Q1-LR=8.50%,Q1-UR=13.98%;50 μmol/L多肽組Q1-LR=5.53%,Q1-UR=8.25%,可以看到當(dāng)多肽濃度在20～50 μmol/L范圍內(nèi)時,細(xì)胞早期凋亡率明顯減少,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),這表明在此范圍內(nèi),多肽濃度的增加減少了細(xì)胞的凋亡。有意思的是,10 μmol/L多肽組早期凋亡率增加(Q1-LR=12.82%),晚期凋亡率減少(Q1-UR=12.08%)(圖7),這可能提示多肽K-YFAE可以促進H9C2心肌細(xì)胞缺氧耐受,但其存在一定的濃度依賴性。進一步采用qPCR檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2)的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與對照組相比,Bax基因的表達(dá)隨多肽K-YFAE濃度增加而降低,Bcl-2基因的表達(dá)隨多肽劑量增加而遞增(圖9)。以上結(jié)果均提示,多肽K-YFAE可能促進H9C2心肌細(xì)胞缺氧耐受,減少其缺氧狀態(tài)下的凋亡。

圖5 多肽K-YFAE對H9C2心肌細(xì)胞缺氧3 h后細(xì)胞形態(tài)的影響標(biāo)尺:100 μm。Fig.5 The effect of polypeptide K-YFAE on H9C2 cardiomyocyte morphology under hypoxia for 3 hoursScale bar:100 μm.

圖6 TUNEL法檢測缺氧處理3 h后各組細(xì)胞凋亡Fig.6 Apoptosis detection by TUNEL assay after hypoxia treatment for 3 hours

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2心肌細(xì)胞缺氧處理3 h后的凋亡Fig.7 Apoptosis of H9C2 cardiomyocytes detected by flow cytometry after hypoxia treatment for 3 hours

圖8 流式細(xì)胞術(shù)檢測H9C2心肌細(xì)胞缺氧處理3 h后凋亡的數(shù)據(jù)分析Fig.8 Analysis of apoptosis of H9C2 cardiomyocytes treated with hypoxia by flow cytometry for 3 hours

圖9 qPCR檢測H9C2心肌細(xì)胞經(jīng)缺氧處理3 h后的凋亡相關(guān)基因Fig.9 Detection of apoptosis-related genes in H9C2 cardiomyocytes treated with hypoxia by qPCR for 3 hours

3 討論

隨著生活節(jié)奏的加快,心肌梗死等心血管疾病成為威脅人類健康的主要疾病之一[6]。目前,雖然藥物治療、溶栓及介入技術(shù)的開展明顯改善了心肌梗死患者的臨床癥狀及生存率,但是現(xiàn)有措施對于已經(jīng)壞死或已經(jīng)瘢痕化的心肌卻無能為力[7]。此外,由于成年人心肌細(xì)胞幾乎沒有再生能力,終末期心臟病成為臨床上不可避免的“老大難”問題。近年來,為探索治療終末期心臟病的更多方法,科研界一直把心臟再生作為研究熱點。科學(xué)研究發(fā)現(xiàn),心臟是可以再生的,且其再生存在某個窗口期[8]。心肌梗死后,梗塞區(qū)域發(fā)生快速血管重建,有研究用全器官成像技術(shù)發(fā)現(xiàn),新生小鼠可再生心臟中存在著側(cè)支動脈網(wǎng)絡(luò),這些側(cè)支動脈是由動脈內(nèi)皮細(xì)胞沿預(yù)先存在的毛細(xì)血管遷移形成的,這一過程稱為“動脈重組”[8]。同時,淋巴管生成在心臟修復(fù)中也起著關(guān)鍵作用,在心肌梗塞后,淋巴管的生成導(dǎo)致7 d后機體免疫細(xì)胞減少,提示新形成的淋巴管有助于心肌梗塞后炎癥的消退[9]。多肽是指由α-氨基酸通過肽鍵連接形成的化合物,一般由3個或3個以上的氨基酸分子構(gòu)成,其因特異性高、毒性低、相對分子質(zhì)量小等諸多獨特優(yōu)勢被廣泛研究并應(yīng)用于臨床實踐中[10～11]。深入探索多肽在心臟再生中的功能,將有助于促進人們對心臟再生機制的理解,亦有望為終末期心臟病的治療提供新的策略。

Crip2是LIM域蛋白家族的Crip型亞組,其在細(xì)胞骨架構(gòu)建、心臟發(fā)育過程、血管和淋巴管形成、腫瘤發(fā)生以及機體免疫等多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)有的研究表明,Crip2蛋白可能通過與相關(guān)通路的重要蛋白質(zhì)相互作用,調(diào)控相關(guān)信號通路(如Wnt信號通路等),參與調(diào)節(jié)機體的病理生理過程[12]。

多肽K-YFAE是筆者所在課題組近期進行的乳鼠心臟再生相關(guān)多肽的篩選項目中應(yīng)用Nano LC-MS/MS技術(shù)所篩選出的興趣多肽,其來源于前體蛋白Crip2,且在小鼠出生7 d后表現(xiàn)為下調(diào)。近年來,肽學(xué)新的研究結(jié)果表明,多肽往往與其前體蛋白功能相近[13]。故此多肽極有可能與Crip2發(fā)揮相似的作用,即參與調(diào)節(jié)心臟的發(fā)育、心功能的維持、傷口愈合、血管形成等。另外,由于此多肽為差異性多肽,且在心臟再生的“窗口期(7 d)”內(nèi)表現(xiàn)為極有意義的下調(diào)。我們有理由推測它是否對心臟再生產(chǎn)生關(guān)鍵的影響。因此,我們針對其前體蛋白Crip2的功能特點,設(shè)計了此實驗,擬觀察多肽K-YFAE對H9C2心肌細(xì)胞增殖及缺氧耐受的影響。

本研究中,通過直接觀察細(xì)胞形態(tài)以及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期,我們發(fā)現(xiàn)多肽K-YFAE確實可以促進H9C2心肌細(xì)胞增殖,使更多的細(xì)胞進入到增殖期,并且隨著多肽濃度的增加,其作用也越明顯。細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測也充分證實了這一點,多肽組隨著多肽濃度的增加,P21基因的表達(dá)逐漸降低,PLK3、E2F1、cyclin C基因的表達(dá)逐漸增加。另外一方面,經(jīng)多肽KYFAE處理后,缺氧后由皺縮恢復(fù)至正常形態(tài)的細(xì)胞數(shù)目增多。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,多肽K-YFAE處理可以使得缺氧引起的細(xì)胞凋亡比例逐漸減小,且在多肽濃度為20～50 μmol/L時,細(xì)胞早期凋亡率減少顯著,表明這種作用可能存在一定的濃度依賴性。同時TUNEL法檢測結(jié)果顯示,多肽K-YFAE處理可顯著減少缺氧誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞的凋亡。在凋亡基因檢測中,多肽K-YFAE的處理可抑制缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的Bax蛋白表達(dá),同時可促進缺氧環(huán)境誘導(dǎo)的Bcl-2蛋白表達(dá)。以上結(jié)果均表明,多肽K-YFAE可以增強H9C2心肌細(xì)胞的缺氧耐受。

多肽K-YFAE的前體蛋白Crip2可能通過與Wnt信號通路的重要蛋白質(zhì)Wnt3a相互作用,調(diào)控Wnt信號通路,參與心肌細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控。研究顯示,Wnt3a在胚胎心肌發(fā)育中可能具有促進作用,并且主要作用在分化早期階段;Wnt3a的減少會破壞心臟菱形肌r6中的Crip2表達(dá),并導(dǎo)致心臟神經(jīng)嵴細(xì)胞異常遷移、心臟功能受損及咽弓發(fā)育的破壞[14]。在心衰大鼠心肌中,Wnt3a表達(dá)上升可能是一種機體自我保護的正反饋機制,可以減少心衰細(xì)胞凋亡,具體的作用機制可能與其下游通路以及caspase-3的下調(diào)有關(guān)[15]。在小鼠出生7 d、心臟失去再生能力后,Crip2蛋白來源的多肽K-YFAE在心臟中的含量明顯下降,這可能是因為Crip2蛋白與Wnt3a相互作用,從而對心肌細(xì)胞生長發(fā)育起到抑制作用。在心肌梗死中,心肌處于缺血、缺氧狀態(tài),蛋白Crip2可能會通過上調(diào)Wnt3a表達(dá)減少心肌細(xì)胞凋亡。由于Wnt信號通路機制復(fù)雜,故Crip2蛋白與Wnt3a是否具有互相調(diào)控的作用,尚需要進一步研究。而多肽KYFAE有望成為此通道新的研究對象,且因其易合成、毒性低、相對分子質(zhì)量小、特異性強等優(yōu)勢,或可為心臟再生或心肌梗死提供新的治療策略。

綜上所述,多肽K-YFAE既可以促進H9C2心肌細(xì)胞的增殖,又可以增強H9C2心肌細(xì)胞的缺氧耐受,發(fā)揮與其前體蛋白Crip2相近的作用,而Crip2蛋白可能參與調(diào)控Wnt信號通路,具體機制尚待進一步研究。