免疫組化與PCR檢測梅毒患者皮損組織蠟塊中梅毒螺旋體的敏感性評價

付 鈺，楊 羚，劉棟華

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一臨床醫學院，廣西 南寧 530021；3.廣西艾滋病防治研究重點實驗室，廣西 南寧 530021）

近年來，隨著人們生活方式逐漸多元化、思想的開放化以及人口流動性增大，我國的梅毒發病率呈上升趨勢。梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）是一種“拒絕”體外培養的病原體［1］，因此，相對其他可體外培養、增殖的傳染病病原體來說，關于TP的研究受到了很大限制，且由于其體積小、重量輕、不易著色，臨床對梅毒的病原學檢測存在一定的局限性。目前，暗視野顯微鏡觀察和鍍銀染色為常用的TP病原學檢測方式，而免疫組織化學法（Immunohistochemistry，IHC）和聚合酶鏈反應法（Polymerase chain reaction，PCR）是較為特異的檢測方式。IHC是通過抗原抗體相結合的原理呈現出皮損組織中TP的分布情況，并加以蘇木素復染來表現組織細胞的形態，而PCR則是在分子水平上檢測樣品中TP的基因片段，間接性反映TP的存在，既往采用PCR檢測TP的研究大多針對早期梅毒患者的血液和皮損組織或分泌物樣本［2，3］，如今該方法已經成為一種成熟的檢測方式。

二期梅毒患者的皮損通常缺乏特異性且呈多樣化，可出現紅斑、丘疹、斑丘疹、斑塊、結節、膿皰或者潰瘍等，因此從皮損的形態容易誤診為其他皮膚性疾病。另外，包括快速血漿反應素環狀卡片試驗（rapid plasma reagin test，RPR）、性病研究實驗 室 試 驗（venereal disease research laboratory test，VDRL）、苯甲胺紅不加熱血清試驗（toluidine red unheated serum test，TRUST）在內的梅毒血清學試驗敏感性高而特異性低，盡管梅毒螺旋體顆粒凝聚試驗（treponema pallidum particle agglutination test，TPPA）為TP特異性診斷，但以上檢測方式均容易在二期梅毒中出現前帶現象，導致檢測結果假陰性，同時，其假陽性也常見于自身免疫性疾病、麻風患者，海洛因成癮者，少數孕婦或老人中［4］。因此，當患者出現多形性皮損，高度懷疑梅毒卻出現診斷困難時，可取患者的皮損組織進行IHC或PCR幫助臨床醫師進一步確診。為了探討兩種方法檢測TP的敏感性，本次研究均選擇梅毒患者皮損組織蠟塊作為檢測樣本，分別使用IHC和PCR方法進行檢測。

1 資料與方法

1.1 樣品來源 選取廣西醫科大學第一附屬醫院皮膚科26名診斷為梅毒的患者的皮損病理活檢組織（包括早期梅毒患者的硬下疳、二期梅毒疹和其他類型的皮損），其中8名患者合并有人類免疫缺陷病毒（human acquired immunodeficiency virus，HIV） 感染，所有組織均進行福爾馬林浸泡固定后用石蠟包埋，以組織蠟塊的形式進行保存和運輸（表1）。

表1 患者一般特征和實驗結果

1.2 研究方法

1.2.1 IHC過程 ① 將患者皮損的組織蠟塊切成3um的薄片，貼附于載玻片上；② 烘烤切片0.5h后用環保脫蠟液進行梯度脫蠟，再用遞減濃度的乙醇溶液（100%，95%，85%，75%）進行梯度水化；③ 高溫水浴的環境下用pH 8.0的EDTA修復樣本抗原；④ 滴加正常山羊血清于切片上孵育30min進行抗原封閉；⑤ 用紙吸干正常山羊血清，將梅毒螺旋體抗體工作液（中杉金橋，中國）均勻地滴在組織上，盡量使抗體工作液布滿整個組織，37℃孵育4h或室溫孵育過夜；⑥ 清洗一抗5min×3次，將山羊抗兔抗體原液（Abcam，英國）進行適當比例稀釋后滴加在切片上，于室溫或37℃孵育30min；⑦ 清洗二抗5min×3次后用紙吸干玻片上多余的水分；⑧ 滴加DAB顯色溶液（中杉金橋，中國）進行切片顯色；⑨ 溫水終止顯色，用蘇木素染液復染組織細胞核20s后用鹽酸酒精分化、溫水反藍；⑩ 用紙吸干切片多余水分，自然風干；滴加透明護甲油封片，光鏡下觀察切片。

1.2.2 DNA提取 ① 將每個皮損組織蠟塊切成5um的薄片，收集包裹完整組織的切片（10～15）片（視組織大小適當增減切片數量），放入1.5ml的微型離心管中；② 離心管中加入適量二甲苯，渦輪振蕩15s，使樣品充分脫蠟后暴露出組織；③ 室溫下離心樣品（13000 rpm）3 min，棄掉上清液；④ 向沉淀中加入無水乙醇，將混合物再次充分振蕩15s后離心（13000rpm）2min；⑤ 棄掉上清液，打開微型離心管蓋子，放置室溫直至乙醇完全揮發。⑥ 使用 QIAamp DNA FFPF TISSUE試劑盒（QIAGEN，德國）進行組織的DNA提取：① 將180uL ALT溶液和20uL蛋白酶K加入沉淀中充分震蕩15s后將樣品置于56℃水浴過夜直至樣品完全裂解；② 次日，將水溫升至90℃后繼續水浴1h（此步驟用于修復組織福爾馬林固定期間發生的部分核酸修飾）；③ 水浴后取出離心管，快速離心，加入200μl Al溶液和200μl無水乙醇；④ 將混合物轉至核酸吸附柱中，離心（8000rpm）1min，棄掉洗脫液（吸附柱不用更換）；⑤ 加入500μl AW1溶液至吸附柱，離心（6000rpm）min，棄掉洗脫液（吸附柱不用更換）；⑥ 加入500μl AW2溶液至吸附柱，離心（14000rpm）3min，棄掉洗脫液（吸附柱不用更換）；⑦ 加入120uL AE溶液，室溫孵育1～5min，離心（6000rpm）1min，留取洗脫液，洗脫液內則包含組織的全部DNA。⑧ 檢測洗脫液中核酸純度與濃度（Thermofisher NanoDrop，USA）。

1.2.3 TP基因鑒定 選擇Tp47基因和poIA 基因分別對組織中的TP進行檢測。采用巢式PCR對Tp47基因片段進行擴增，以Tp47K-1 （5′-GTTGAGTATTGGGCCGAAA-3′）和Tp47K-2（5′-ATACCGTTCGCAATCAAAG-3′）作為其外引物，用K03A（5′-GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT-3′）和K04（5′-CAGCCATCAGCCCTTTTCA-3′）作為其內引物，最終擴增得到大小為261bp的基因片段［6］。采用普通PCR方式對poIA基因進行擴增，以poIA-1（5′-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3′）為 上游 引 物，poIA-2（5′-CACAGTGCTCAAAAACGCCT GCACG-3′）為下游引物，最終獲得大小為378bp的基因片段［7］。PCR反應體系中包含25uL 2×Santaq PCR Mix（上海生工生物，中國）、X uL DNA模板（X為DNA模板體積量，測量并計算維持核酸濃度在1～10 ng/μl之間）、上下游引物各2uL，最后用dd H20補充至50uL。 PCR 的熱循環（SimpliAmp PCR儀，ABI，USA）過程如下：預變性94℃ 5min；變性94℃ 30s，退火55℃ 30s，延伸72℃ 40s，變性至延伸一共持續35個循環；終延伸72℃ 10min；PCR產物保存于4℃。使用3%瓊脂糖凝膠（索萊寶生物，中國）電泳進行PCR產物純化，Marker 選用50bp DNA Ladder（天根生物，中國），通過紫外線凝膠成像儀（Syngene G：BOX，英國）顯像。

2 結果

一共26例樣本均為IHC陽性，陽性率為100%。可見TP沿著表皮中、下部分及血管上皮周圍分布（圖1）。7例樣本顯示Tp47-PCR陽性，9例樣本顯示poIA-PCR陽性（圖2），陽性率分別為27%和35%，同時，poIA-PCR陽性樣本包括了Tp47-PCR陽性樣本。

圖 1 IHC 結果圖

圖 2 TP-PCR 結果

（1a：TP沿表皮中、下部分布（IHC×200）；b：TP浸潤血管上皮及其周圍（IHC×400））。

3 討論

梅毒螺旋體PCR （TP-PCR）檢測現已被推薦為診斷一期或二期梅毒的有效手段［5］，TP的感染與否可以在基因水平上得到證實，為梅毒的診斷提供病原學證據。Tp47基因編碼一種參與TP細胞壁合成的細胞質膜蛋白（47KDa）［5，6］，是最常用的TP-PCR檢測的靶基因。本研究采用巢式PCR擴增Tp47基因片段的優勢在于：一方面，普通PCR檢測中目標DNA片段數量較少時普通PCR靈敏度低、不穩定、重復性差，而巢式PCR則可以通過二次擴增提高其檢測敏感度［8］；另一方面，第二次擴增的片段是第一次擴增片段的一部分，提高了檢測的特異度。

poIA 編碼DNA聚合酶I，參與DNA的修復，盡管poIA 基因在大多數細菌的生理過程中參與其遺傳物質的復制，但在TP的基因表達中表現出很強的特異性［9］。在 Gayet-Ageron 等人的研究中，比較了Tp47-TP-PCR 與 poIA-TP-PCR 在相同臨床標本上的檢測［10］，發現兩者敏感度性幾乎完全一致，甚至可以相互替代檢測，因此，本研究選擇在檢測Tp47基因同時，同時檢測poIA基因作為對比。從實驗結果可看出，兩個靶基因的的陽性率也極為接近。

本研究的實驗結果表明，IHC檢測梅毒患者皮損組織蠟塊中TP的陽性率明顯高于PCR（表1）。在 Hoang 等人的研究中，比較了17例二期梅毒患者19例皮損組織樣本蠟塊中的IHC和銀染色結果，顯示IHC檢測敏感度為71%，優于銀染色的41%（p=0.084）［11］；在 Buffet等人的研究中，將12例二期梅毒患者的皮損活檢組織蠟塊分別進行IHC（91%）與基于TP47基因的PCR檢測，結果顯示IHC（91%）檢測敏感度優于PCR檢測（75%）［12］；Behrhof等人的研究中，20例二期梅毒患者皮損組織蠟塊標本通過免疫組化、銀染色或和PCR檢測，免疫組化檢測17/35（48.6%）例陽性，銀染色9/35（25.7%）例陽性，PCR檢測14/36（38.9%）例陽性［13］。可見無論是相較于銀染或PCR，IHC對梅毒患者皮損組織蠟塊的檢測敏感性均較高。

在既往的報道中，Cuini Wang等人運用PCR檢測262例不同分期梅毒患者（84例一期梅毒、97例二期梅毒和81例潛伏梅毒）的全血TP-DNA，結果顯示，初期與二期梅毒患者的DNA檢測陽性率分別為53.6%和62.9%，遠高于潛伏梅毒患者（7.4%）（p＜ 0.001）［2］；Palmer等人對梅毒患者肛門-生殖器或口腔潰瘍拭子新鮮標本進行PCR檢測，結果顯示在一期梅毒的檢測中，PCR的敏感度為94.7%，特異度為98.6%，陽性預測值為94.7%，陰性預測值為98.6%；二期梅毒的靈敏度為80%，特異性為98.6%，陽性預測值為88.9%，陰性預測值為97.2%［3］。由此得知，PCR在檢測非蠟塊的樣本敏感度相對蠟塊樣本高。

對于本研究中PCR檢測組織蠟塊敏感性較低的原因，我們認為可能為以下幾點原因：① 福爾馬林容易在空氣中氧化成為甲酸，甲酸對于DNA有很強的降解作用，因此使用陳舊的福爾馬林溶液固定組織或固定時間過長都會使樣本中的DNA降解，從而使得擴增效率降低；② 組織固定后，核酸蛋白廣泛地交聯，使DNA與蛋白質形成牢固的復合物，DNA容易斷裂成為不完整的片段，導致DNA不容易被提取；③ 在福爾馬林固定過程中，嘌呤基、堿基與組蛋白之間形成了以多聚甲醛為介體的甲基橋，導致DNA的交聯，在石蠟包埋過程中隨機降解［14］；④ 盡管在從標本中提取DNA的過程中，采用高溫水浴盡可能減少福爾馬林溶液對抗原的交聯抑制。但由于每塊組織的大小不均勻，選擇的切片數量也不相同，人為因素會導致裂解和修復過程不完全；⑤ 操作過程中樣本量的損失；⑥ 樣本中的病原體載量小。

本研究的結果表明，IHC對于梅毒患者皮損組織蠟塊樣本來說，是一種特異性與敏感性都很高的病原體檢測方法，顯色后可在光鏡下清楚觀察到皮損中TP的分布。但是，IHC具有檢測樣本的局限性，對于血液、唾液、分泌物樣本，即便可風干固定于玻片之上，仍不能避免樣本在IHC過程中反復被清洗而導致的損耗。另一方面，這些樣本的內容物多樣，若涂片不均，則會導致視野背景雜亂，影響閱片質量。PCR檢測可以避免上訴非組織蠟塊樣本造成的影響，因此對于無皮疹的梅毒患者的血液、唾液、分泌物樣本，PCR不失為一種敏感度和特異度相對較高的檢測輔助性檢測。

綜上所述，IHC對梅毒患者皮損組織蠟塊中TP的檢測敏感性高于PCR，對于臨床出現多樣化皮疹損，高度懷疑梅毒的患者卻出現診斷困難時，IHC可作為一種針對皮損組織蠟塊的準確、敏感的特異性檢測方式，幫助臨床診斷。