面向植物抗旱性研究的多源表型信息采集和分析技術

張慧春 楊琨琪 李楊先 邊黎明 郝明灼

(1.南京林業大學機械電子工程學院， 南京 210037； 2.南京林業大學林學院， 南京 210037； 3.南方現代林業協同創新中心， 南京 210037)

0 引言

干旱是全球最普遍和最嚴重的自然災害，全球每年因干旱造成經濟損失達80億美元，遠超其他氣象災害[1]。近些年，全球氣溫不斷上升，各地區水資源逐漸匱乏，嚴重影響植物的生長和產量。干旱環境中，植物自身進化出一系列自我保護和適應與抵制不利環境脅迫的機制，其表型特征會發生顯著改變，來盡可能降低逆境環境對其生長發育的影響[2-5]，例如，植物可通過降低株高來縮短地下水分到達地上部分的距離，有利于水分的上下傳輸等[6]。表型是指受基因和環境決定或影響的復雜植物性狀，包括生長、發育、耐性、抗性、生理、結構、產量等。可測量的表型參數分為形態結構表型參數和生理生化表型參數，其中形態結構參數包括植物高度、葉形態、根形態、生物量、果實特征；生理表型參數包括葉片水分利用率、葉綠素、細胞膜透性、光合速率等[7-11]。因此，研究植物在干旱脅迫下的表型變化，解析植物對不同環境變化的適應機制，將會有助于在應對全球氣候變化時培育耐旱品種，對保障農林可持續發展具有重要意義。

植物生長過程中受多種因素共同作用，因此干旱等逆境造成的植物表型性狀體現出復雜性。盡可能多的獲取植物的表型參數有助于實時了解植物在干旱脅迫下的長勢，從而對植物的生長發育進行指導管理。隨著圖像處理技術的迅速發展,表型圖像采集的方法種類也愈來愈多，成像傳感器的應用越來越廣泛。每種成像方式都從植物獲取某些信息，不同的成像方法可以提供同一植物不同方面的信息[12]。植物具有特殊的變異性、隨機性和復雜性，它的生長發育、生理生化變化都受到各種因素影響，完整而豐富的植物表型信息無法依賴某一個傳感器來獲取，單獨從某一種圖像中也無法得到全面的表型信息。在植物表型研究中通過多個傳感器的協同來獲取多源表型信息，并采用一定的數據關聯性分析，可以得到植物的形態表型參數及生理參數。因此，構建表型信息采集平臺，使用多個傳感器采集同一目標植物的信息，經過適當處理，將采集的多源表型信息關聯分析、綜合互補，是獲取準確客觀的植物表型信息的有效方法。

簸箕柳(SalixsuchowensisCheng)是楊柳科柳屬植物，基因組大小為356 Mb，具有易繁殖、速生豐產和輪伐期短等特點，是重要的生物質能源和造林用材樹種[13]。本文以模式樹種楊樹的姐妹屬植物簸箕柳苗木為研究對象，構建一套多源信息采集系統，對獲取到的表型信息進行關聯分析，實時、連續監測簸箕柳苗木的生長狀況，指導抗性育種中水分的施用和抗旱基因型的快速篩選，以期為簸箕柳苗木的抗旱性表型指標篩選提供研究平臺和技術支撐[14-15]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料選取直徑(4±0.2) mm、高度(12±0.3) cm的40段簸箕柳枝條進行扦插式種植，以南京林業大學林區有機土壤為基質，放入花盆(直徑10 cm，高11.5 cm)中，并置于人工氣候箱(RXZ型，寧波江南制造廠)中培養，人工氣候箱的環境參數設置如下：相對濕度65%、溫度28℃、光照強度278 μmol/m2、晝夜時間比16∶8。扦插種植第12天，將長勢相同的簸箕柳分為2組，每組20株。其中一組20株進行正常施水處理，另一組20株進行干旱脅迫處理。正常施水處理組，通過水分控制模塊與稱量模塊，保持每盆總質量為950 g。干旱脅迫處理試驗分2個階段進行，第1階段是從第26天開始到第42天結束，每4 d隨機選取2株進行破壞性取樣，第26天第1次取樣測量，16 d共記錄5次，共計10株，每次將取樣得到的植株立即稱量以獲得植株鮮質量(Fresh weight，FW)，之后將該植株置于70℃的電熱恒溫鼓風干燥箱(DHG-9101-2SA型)中保存24 h，稱量獲取植株干質量(Dry weight，DW)。干旱脅迫試驗第2階段是從扦插后第42天開始到第62天結束，剩余未進行破壞性取樣的10株植物繼續在培養箱中生長并每2 d進行成像。這一階段不進行破壞性取樣，直至試驗結束。

1.2 多源表型信息采集平臺設計與圖像獲取

本文構建的多源表型信息采集平臺由圖像采集模塊(GO-5000C-PGE型，分辨率2 560像素×2 048像素，LM8HC-SW定焦鏡頭)、熱成像儀(FLIR T460型，熱靈敏度小于0.03℃@+30℃)、自動稱量模塊、水分精確控制模塊、光源及平臺框架組成，如圖1所示。其中平臺框架的尺寸為1 m×1 m×1.5 m，目標植物位于平臺中心處。圖像采集模塊中2個垂直擺放的CCD 相機從不同角度采集植物形態結構表型信息。熱成像儀用于獲取植物的冠層熱成像圖像。自動稱量、水分精確控制模塊主要包括壓力傳感器、A/D轉換芯片、繼電器、電磁閥、水泵等器件。自動稱量模塊獲取植株的質量。水分精確控制模塊根據獲取的植株質量信息與預先設定的質量之間的差值來精確施加定量的水分。光源用于確保拍攝環境的穩定可靠，盡量減少噪點對后期圖像處理的影響。

圖1 多源表型信息采集平臺Fig.1 Multi-source phenotypic information collection platforms1.水分精確控制模塊和自動稱量模塊 2.圖像采集模塊 3.目標植物 4.平臺框架 5.光源 6.熱成像儀

1.3 圖像處理算法

1.3.1彩色圖像處理算法

為了便于提取彩色圖像中植株信息，需要將彩色圖像中植株部分分割出來。目前較為成熟的目標分割多采用圖像處理技術，該方法可以通過閾值分割算法實現前景和背景的分離，實現目標識別，圖2為利用圖像處理技術檢測簸箕柳的流程圖。但是該方法受光照不均、反光或背景復雜等因素影響，存在最優閾值求解困難、適應性差、分割效率低下等缺點。

圖2 圖像處理算法分割簸箕柳效果Fig.2 Effect drawings of image processing algorithm segmentation of Salix suchowensis Cheng

針對傳統圖像處理技術存在的缺點，本文提出了一種新的自動圖像分割算法，在對目標圖像進行自動分割之前，基于目標檢測算法YOLO v3(You only look once v3)對目標區域進行定位與識別[16-20]，定位與識別到圖像中植物與紅色標定板區域并設置為感興趣區域(Region of interest，ROI)，再基于顏色信息分割出植物和紅色標定板，圖3為利用YOLO v3檢測簸箕柳的方法示意圖。

考慮到簸箕柳葉片和莖的生長具有隨機性，且深度學習算法需要大量的數據，本文使用CCD相機采集簸箕柳圖像共3 600幅，其中90%用于訓練，10%用于測試。所有的訓練和測試均在處理器為AMD Ryzen 7 2700，內存16 GB，GPU為NVIDIA 1660Ti的臺式計算機上完成，并使用Tensorflow 1.6.0的深度學習框架進行訓練。使用基于動量的隨機梯度下降法來訓練數據，動量設置為0.9，初始學習率設為0.001，共訓練了200個周期(epoch)。模型在前15個epoch中迅速擬合，損失值快速減少，到達第100個epoch后逐漸穩定。為了避免模型出現過擬合，本文選用第100個epoch的模型權值進行試驗。

圖3 利用YOLO v3檢測簸箕柳圖像方法示意圖Fig.3 Image method schematic of Salix suchowensis Cheng detected by YOLO v3

利用輸出的目標檢測模型進行試驗，可以檢測到簸箕柳和紅色標定板區域。設置圖中簸箕柳和紅色標定板為感興趣區域，其中的紅色標定板為了提取表型參數而設立[21]。為了便于提取圖像中的信息，通過2G/(R+B)和2R/(R+B)這2種色彩參數將2個感興趣區域轉換為單波段圖像[22]，并通過超綠色灰度算法對簸箕柳區域進行灰度化處理。經過超綠色灰度化處理后的圖像包含噪點，為獲取去噪后簸箕柳的精確圖像，本文采用了形態學操作中的開運算對圖像進行降噪處理。之后利用邊緣檢測算法對圖像中的簸箕柳邊緣提取、標注和連通，從而獲取到簸箕柳的分割圖像。CCD相機采集的簸箕柳圖像分割過程及效果如圖4所示。

圖4 CCD相機采集的簸箕柳圖像分割過程示意圖Fig.4 Image segmentation processing diagrams of Salix suchowensis Cheng by CCD camera

對比使用傳統圖像處理算法與本文提出的自動圖像分割算法對采集到的圖像中簸箕柳進行分割的效果，如圖5所示。由圖5可知，基于傳統圖像處理算法會因為葉片尺寸不同、花盆材料反光、背景復雜等原因，存在閾值設定不合理造成簸箕柳圖像出現葉片局部斷裂、邊界輪廓不連續、整體模糊、分割不完全等現象，影響了后期植物表型參數的精準提取。而本文先基于目標檢測算法YOLO v3對目標區域進行定位與識別，再通過圖像處理算法進行圖像處理，避免了傳統圖像處理算法分割時出現的問題，由此可見本文算法適應性更好，精度更高，提升了識別算法的魯棒性，提高了表型數據的獲取效率，保證了數據的客觀準確性。

圖5 兩種算法的簸箕柳圖像分割效果對比Fig.5 Comparison of two algorithms for image segmentation effect of Salix suchowensis Cheng

1.3.2紅外熱圖像處理算法

采用紅外熱成像檢測技術來檢測簸箕柳不斷散發出的熱輻射能，用于研究簸箕柳體內水分與冠層溫度之間的關系。采集簸箕柳紅外熱圖像過程中，由于圖像對比度較小以及噪聲的存在，使得圖像中很多細節比較模糊。采用直方圖均衡算法進行圖像增強，經過直方圖均衡化后的簸箕柳熱紅外圖像去除了周圍的環境溫度，突出了簸箕柳的紅外熱成像信息。但是周圍仍然存在比較明顯的噪聲，為獲取準確的冠層信息，需要去除周圍的噪聲，采用中值濾波算法去除直方圖均衡化后的紅外熱圖像噪聲，并通過Matlab中人工交互式選區的方法去除花盆區域，最后將圖像轉換為二值化圖像，圖6為紅外熱成像儀采集的簸箕柳圖像處理效果。在FLIR Tools軟件中將整幅紅外熱圖像的溫度信息導出，每個像素點都對應著其所在位置的溫度信息。通過提取二值化圖像中白色區域(即像素值為1)的像素位置，然后將這些像素位置所對應的溫度信息提取出來并計算平均值，便可以將冠層溫度提取出來。

圖6 紅外熱成像儀采集的簸箕柳圖像處理效果Fig.6 Image processing flows of Salix suchowensis Cheng by infrared thermal image

2 植物表型參數提取

2.1 投影葉面積與株高

經過圖像分割得到簸箕柳圖像后，通過像素計數法計算側視投影葉面積(Projected area，PA)所占像素區域面積。繪制簸箕柳圖像的最小包圍矩形，利用已知尺寸(2 cm×2 cm)的紅色正方形標定板進行比例縮放，從而得到植株投影葉面積與株高，為了減小誤差，結果取2個角度所得的平均值。簸箕柳的側視投影葉面積計算方法為

(1)

式中SPA——實際簸箕柳的側視投影葉面積，cm2

Slabel——標定板實際面積，取4 cm2

Nlabel——二值圖像中標定板投影區域像素數

Nplant——二值圖像中簸箕柳投影區域像素數

簸箕柳的株高計算方法為

(2)

式中Hplant——實際簸箕柳的株高，cm

Clabel——標定板的實際周長，8 cm

2.2 葉片數量

本文對原始的霍夫直線變換算法進行改進，首先在簸箕柳的二值化圖像中使用直線檢測算法識別到簸箕柳的莖，之后根據識別到的2條直線設置左、右距離從而限定出莖的范圍，將線段內的所有像素點去除，便可以將莖去除。并基于二值圖像尋找簸箕柳葉片輪廓，并將每一個輪廓用彩色顯示出來。最后通過骨架提取算法將簸箕柳骨架提取出來。在骨架提取的基礎上，對葉片數量(Leaf number，LN)進行提取，圖7e中紅色圈內為有交點的葉片，如果葉片發生了交叉，則交叉的葉片為一個區域。如果葉片沒有交叉，則單獨的葉片為一個區域。葉片數量的計算方法為：所有的葉片區域數目加交點個數。普通非交點處像素周圍最多有2個值為1的像素點，而交點周圍的像素值為1的點至少有3個(如圖7e中細節放大圖)。因此檢測交點的方法為：遍歷骨架提取二值化圖像的所有像素點，如果像素值為1，則此處為白色，然后遍歷該像素點周圍的8個像素點。如果有3個像素的值為1，則此處為交點。此算法可能會在交點處檢測到2個點，保留1個即可。該葉片數量提取算法面對一般情況的葉片交叉具有較好的魯棒性，基本滿足葉片數目提取需求。

圖7 簸箕柳去莖處理及骨架提取效果圖Fig.7 Flow charts of stem removal and skeleton extraction of Salix suchowensis Cheng

2.3 耗水量和水分利用效率

耗水量可以定義為蒸騰、土壤水分蒸發蒸騰損失總量或系統總水量的輸入[23]，是研究植物體內水分的一個重要表型參數。水分利用效率是灌溉和耐旱研究的重要指標，通常定義為生物量積累與耗水量的比值[24]。本試驗中水分利用效率定義為每單位水分損失所產生的地上部分干物質量[25]。

平臺的稱量模塊、水分精確控制模塊和估測的簸箕柳植株鮮質量和植株干質量，可以用來估算每株簸箕柳的日耗水量(即土壤水分蒸發蒸騰損失總量(Evapotranspiration，ET))和水分利用效率(Water use efficiency，WUE)。

ET=[mi，after-mFW,i-(mi+1,before-mFW,i+1)]/T

(3)

WUE=(mDW,i+1-mDW,i)/(TET)

(4)

式中ET——土壤水分蒸發蒸騰損失總量

WUE——水分利用效率

mi,after——第i次施水后總盆質量，g

mi+1,before——第i+1次施水前總盆質量，g

mFW，i——第i次稱取的植株鮮質量，g

mFW，i+1——第i+1次稱取的植株鮮質量，g

mDW，i——第i次稱取的植株干質量，g

mDW，i+1——第i+1次稱取的植株干質量，g

T——時間間隔，取2 d

3 干旱脅迫試驗下植物表型參數分析

3.1 不同水分處理下植株的表型參數對比

圖8為不同水分處理下簸箕柳的生長圖像，正常水分和干旱脅迫下的植物都是從第12天開始進行形態表型參數的采集，采集周期為8 d。由于從扦插后的第52天開始，干旱脅迫植株出現明顯枯萎狀態，因此干旱脅迫植株從扦插后的第52天開始停止形態表型參數的采集。干旱脅迫植株一共進行了6次(分別是扦插后的第12、20、28、36、44、52天)形態表型參數的采集，正常施水植株一共進行了7次(分別是扦插后的第12、20、28、36、44、52、60天)形態表型參數的采集。因此正常施水植株進行了7次三維形態模型的重建，正常施水植株相應時期拍攝的實際真實圖像與模型重建圖如圖8a所示，干旱脅迫植株進行了6次三維形態模型的重建，干旱脅迫植株相應時期拍攝的實際真實圖像與模型重建圖如圖8b所示。由圖8可見，株高、植物鮮質量、葉片數量等表型參數在干旱脅迫條件下比正常施水情況下明顯小。

圖8 2種不同水分處理條件下真實圖像與模擬圖像對比Fig.8 Comparisons of real and simulated images under two different water treatment conditions

對正常施水與干旱脅迫2種不同處理下的簸箕柳表型參數進行描述統計，數據如表1所示。由表1可知，正常施水植株的株高顯著大于干旱脅迫植株的株高，且正常施水植株的投影葉面積也顯著高于干旱脅迫植株，而2種處理下的簸箕柳葉片數量沒有顯著差別，說明正常施水植株的葉片增長速率高于干旱脅迫植株的葉片增長速率。正常施水植株日耗水量顯著高于干旱脅迫植株，原因可能是正常施水植物生長較快增加了對水的需求，相應的蒸騰作用也會增強，同時干旱脅迫植株啟動了對干旱脅迫的節水響應(如氣孔關閉)，從而降低水分的消耗。由于花盆表面的水分蒸發損失較大，2種水分脅迫下的植物日耗水量較多，因此水分利用效率均較低。

利用多源表型信息采集平臺獲取不同水分條件下的植株表型參數，繪制出各表型參數描述統計表(表1)，更加直觀地表現出干旱脅迫對植株形態及生理表型參數的影響，也為植株干旱評估提供了幫助與參考。

3.2 植株投影葉面積與地上部分鮮質量、干質量關聯分析

采用試驗階段破壞性獲取的方式得到簸箕柳鮮質量和干質量參數，并與植株投影葉面積進行關聯分析。植株投影葉面積與植株鮮質量之間的相關性如圖9a所示，植株投影葉面積與植株鮮質量之間呈現很高的線性正相關性，決定系數R2為0.89；植株投影葉面積與植株干質量之間的相關性圖如圖9b所示，植株投影葉面積與植株干質量之間呈現線性正相關性，決定系數R2為0.78；植株干質量與植株鮮質量之間的相關性如圖9c所示，植株干質量與植株鮮質量之間呈現線性正相關性，決定系數R2為0.76。由此可見，通過多源表型信息采集系統采集到簸箕柳投影葉面積，可以估算出簸箕柳的鮮質量與干質量，從而計算出簸箕柳植株的含水率，以便評估簸箕柳干旱情況。

表1 不同處理方法下的簸箕柳表型參數描述統計Tab.1 Statistics of Salix suchowensis Cheng phenotypic parameters under different treatment conditions

圖9 植株投影葉面積、植株鮮質量、植株干質量相關性分析Fig.9 Analysis diagrams of relationship between plant projected area and plant fresh weight and dry weight

圖10 冠層溫差、時間、日耗水量差之間相關性分析Fig.10 Relationships between canopy temperature difference and time and daily water consumption difference

3.3 冠層溫度與日耗水量關聯分析

植物冠層溫度反映冠層的能量平衡狀況，與植物光合生理特性及產量形成密切相關，是一個很好的干旱監測指標，已有研究[26]表明植物蒸散量與冠層溫度之間密切相關，基于能量平衡原理，可利用冠層溫度估算植物蒸散量，并進行精量灌溉決策。植物的冠層溫度受環境溫度影響較大，在采集冠層溫度時，無法保證環境溫度完全相同，因此此處研究不同水分處理條件下植物的冠層溫差隨時間的動態變化。本文對不同水分處理條件下植物的平均冠層溫差(干旱脅迫植株冠層溫度減去正常施水植株冠層溫度)與平均日耗水量差(干旱脅迫植株日耗水量減去正常施水植株日耗水量)和時間進行了關聯分析，相關性如圖10所示。由圖10a可知，冠層溫差與扦插后時間呈現正相關，決定系數R2為0.79；扦插初期，2種處理下的植物冠層溫差并未明顯變化，但是隨著時間推移，冠層溫差逐漸變大，最大溫差達到0.9℃。冠層溫度受土壤水分環境調控，隨著干旱脅迫程度的加重，土壤中水分供應不足，植株蒸騰作用減弱，蒸騰耗熱減少、感熱通量增加，從而使得植株冠層溫度上升；由圖10b可知，日耗水量差與扦插后時間呈現出一定的正相關，決定系數R2為0.84。扦插初期，由于土壤水分含量較高，可以保證植物正常供水，葉片耗水量都處于正常范圍。隨著干旱脅迫的加劇，2種處理下的植物日耗水量差明顯變大，最大達到20.4 g/d。原因可能是隨著時間推移，干旱脅迫程度的加重，呼吸作用加強，干旱脅迫迫使植物產生應激反應(如氣孔關閉)，導致植物的蒸騰作用減弱，葉片溫度上升，從而使得日耗水量差值變大。由圖10c可知，日耗水量差與冠層溫差呈現出一定的正相關，決定系數R2為0.85。可見，通過使用表型信息采集系統中的熱成像模塊獲取2種不同水分條件下的冠層溫差，可以對植株的受干旱脅迫程度進行監測與評估，也為評判植物中的水分輸送利用提供了技術依據。

4 結論

(1)設計并構建了面向簸箕柳表型分析的多源表型信息采集平臺。該平臺主要由圖像采集模塊、熱成像模塊、自動稱量模塊、水分控制模塊組成。實現了植物圖像采集、冠層熱成像圖像獲取、水分精確控制等功能。

(2)基于YOLO v3目標檢測算法檢測并分割出圖像中的感興趣區域，并利用圖像處理技術提取了植物的形態結構表型參數(株高、投影葉面積、葉片數量)。其中葉片數量是通過將原有的霍夫直線檢測算法進行改進，從而準確提取出簸箕柳的莖，使得簸箕柳的莖葉分離，進一步通過骨架提取算法提取得到葉片數量。通過對熱成像儀得到的紅外圖像處理，獲得更準確的冠層溫度。

(3)設計了干旱脅迫試驗，對不同處理下的簸箕柳表型信息參數進行了對比以及相關性分析。結果顯示干旱脅迫下的簸箕柳株高、投影葉面積、日耗水量、水分利用效率都隨時間推移顯著低于正常施水下的簸箕柳，而冠層溫度卻高于正常施水下的簸箕柳。通過相關性分析得出：簸箕柳投影葉面積與鮮質量及干質量都呈現線性正相關，決定系數分別為0.89和0.78；植株鮮質量與植株干質量之間呈現線性正相關，決定系數為0.76；扦插后時間與平均冠層溫差之間呈正相關，決定系數為0.79；日耗水量差與扦插后時間呈現出一定的正相關，決定系數為0.84；冠層溫差與日耗水量差呈正相關，決定系數為0.85。

(4)面向植物抗旱性研究的多源表型信息采集平臺能夠擴大傳感范圍，使獲取的目標植物表型信息更加豐富完善，提高系統可靠性的同時增強了表型信息的利用效率。在植物未遭受嚴重的干旱脅迫時，通過采集得到植株投影葉面積、熱成像信息等表型參數，可以對植物的鮮質量、干質量、水分利用效率進行估算，實現對植株受干旱脅迫程度的評估。