阿拉爾市售鴿蛔蟲(chóng)種類(lèi)的分子鑒定

信璐瑤 石帥鋒 劉祥杰 齊萌 王云峰 鄧金華 余復(fù)昌

摘 要：為了解阿拉爾市售鴿的蛔蟲(chóng)感染種類(lèi)，采用剖檢法對(duì)從阿拉爾市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的110羽鴿進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)14羽感染蛔蟲(chóng)，感染率為12.7%（14/110）;共獲蟲(chóng)體188條，最大感染強(qiáng)度為48條/羽。隨機(jī)提取10條蟲(chóng)體DNA，分別基于線(xiàn)蟲(chóng)SSU rDNA、nad2和cox1基因位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，結(jié)果顯示：所獲蟲(chóng)體的SSUrDNA和nad2基因序列與雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)同源性分別為99.9%和100%;cox1基因序列與鴿蛔蟲(chóng)同源性為97.9%;鑒定本次分離的蟲(chóng)體為雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)。進(jìn)化分析顯示，本次所獲鴿源蛔蟲(chóng)分離株與雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)分離株聚類(lèi)在一支，而與其他屬蛔蟲(chóng)處于不同分支。研究結(jié)果為鴿源蛔蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定提供了基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：蛔蟲(chóng);鑒定;種類(lèi);鴿

中圖分類(lèi)號(hào)：S836 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2022）02-0005-06

蛔蟲(chóng)病是鴿常見(jiàn)的腸道寄生蟲(chóng)病，可引起翅膀下垂、羽毛蓬亂、呆立萎靡、飛行能力降低和異嗜癖等癥狀，在我國(guó)各地廣泛流行[1]。蛔蟲(chóng)發(fā)育不需要中間宿主，主要是感染性階段的蛔蟲(chóng)卵通過(guò)污染用具、飼料、飲水等途徑傳播和感染。蛔蟲(chóng)可感染各年齡段鴿，臨床癥狀表現(xiàn)主要跟感染強(qiáng)度呈正相關(guān)，感染強(qiáng)度大時(shí)可導(dǎo)致鴿群發(fā)生死亡，對(duì)養(yǎng)鴿業(yè)造成較大的危害[2]。報(bào)道顯示，寄生于禽類(lèi)的蛔蟲(chóng)種類(lèi)至少有8種，我國(guó)禽類(lèi)常見(jiàn)感染的種類(lèi)有雞蛔蟲(chóng)（Ascaridia galli）、鴿蛔蟲(chóng)（Ascaridia columbae）和雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)（Ascaridia nymphii），其中雞蛔蟲(chóng)和鴿蛔蟲(chóng)均可感染鴿，雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)主要感染鸚鵡[3]。

傳統(tǒng)的蛔蟲(chóng)分類(lèi)鑒定是對(duì)成蟲(chóng)蟲(chóng)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，該法簡(jiǎn)單便捷，但需要經(jīng)驗(yàn)豐富者進(jìn)行鑒定，形態(tài)相近的種類(lèi)不能有效區(qū)分，具有一定局限性。分子生物學(xué)技術(shù)在寄生蟲(chóng)種類(lèi)鑒定方面具有較好的特異性和敏感性，可通過(guò)序列差異揭示物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，常用的蛔蟲(chóng)分子標(biāo)記有核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（cox1）、核糖體小亞基（SSU rDNA）和煙酰胺脫氫酶亞基II（nad2）等[1，4]。

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們對(duì)鴿產(chǎn)品的市場(chǎng)需求不斷增加，肉鴿養(yǎng)殖已成為新興家禽產(chǎn)業(yè)之一。新疆南疆地域廣泛，人口密度低，自古有肉鴿養(yǎng)殖的傳統(tǒng)，近年來(lái)為促進(jìn)當(dāng)?shù)鼐蜆I(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，政府大力倡導(dǎo)肉鴿產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5]。然而，受多種因素影響，新疆南疆地區(qū)肉鴿養(yǎng)殖以農(nóng)牧民和小型養(yǎng)殖場(chǎng)為主，養(yǎng)殖人員疫病防治知識(shí)水平偏低，飼養(yǎng)管理水平不高。為了解阿拉爾市售鴿感染情況及其種類(lèi)，采用系統(tǒng)剖檢法和PCR法對(duì)鴿進(jìn)行調(diào)查和檢測(cè)，以期為鴿蛔蟲(chóng)病的防治提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 鴿的蛔蟲(chóng)樣本收集

自阿拉爾市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)110羽鴿，采用系統(tǒng)剖檢法進(jìn)行剖檢。經(jīng)肉眼觀察，將在腺胃、肌胃及腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛔蟲(chóng)成蟲(chóng)，置于70%乙醇中保存。

1.2 蛔蟲(chóng)蟲(chóng)體DNA提取

從鴿體內(nèi)檢出的所有蛔蟲(chóng)中，隨機(jī)選取10條蛔蟲(chóng)，各剪一段5 mm蟲(chóng)體，分別置于無(wú)菌的1.5 mL離心管中，充分研磨后，采用組織基因組DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）按照操作說(shuō)明步驟提取蟲(chóng)體DNA，置-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

參考文獻(xiàn)報(bào)道[3，4，6]分別設(shè)計(jì)線(xiàn)蟲(chóng)通用的SSU rDNA、nad2和cox1基因的引物序列，由蘇州金維智生物科技有限公司合成，引物序列和反應(yīng)程序見(jiàn)表1。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL：2× EasyTaq PCR SuperMix （北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）12.5 μL，雙蒸水 10.9 μL，上下游引物各0.3 μL，DNA 模板1 μL。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL第二輪PCR產(chǎn)物加入1%的瓊脂糖凝膠膠孔中，110 V電壓電泳30 min，置凝膠成像分析系統(tǒng)中觀察并拍照。

1.4 序列比對(duì)和種系發(fā)育分析

成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測(cè)序，由蘇州金維智生物科技有限公司完成。測(cè)序所獲序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源序列搜索，用Clustal X 2.1軟件進(jìn)行比對(duì)分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果鑒定蛔蟲(chóng)種類(lèi)。下載相關(guān)蛔蟲(chóng)同源序列，采用Mega 6.0軟件，選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建種系發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，其可靠性用Bootstrap分析檢測(cè)，進(jìn)行1 000個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 鴿的蛔蟲(chóng)檢查和PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)110羽鴿進(jìn)行剖檢，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)有14羽感染蛔蟲(chóng)，感染率為12.7%（14/110）。14羽呈蛔蟲(chóng)感染陽(yáng)性的鴿中，最大感染強(qiáng)度為48條/羽，共收集蛔蟲(chóng)蟲(chóng)體188條。

分別基于SSU rDNA、nad2和cox1基因位點(diǎn)，采用PCR法擴(kuò)增隨機(jī)選取的10條蛔蟲(chóng)DNA樣本，分別擴(kuò)增出約845、266 bp和450 bp的條帶，與目的片段相符，分別見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

2.2 鴿的蛔蟲(chóng)序列分析

在SSU rDNA基因位點(diǎn)，成功獲得10條蛔蟲(chóng)序列，序列一致，均與來(lái)自日本的雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)（LC057210） 同源性為99.9%，存在1個(gè)堿基差異，在第25核苷酸位置存在插入堿基A。

在nad2基因位點(diǎn)，成功獲得10條蛔蟲(chóng)序列，序列一致，均與來(lái)自日本的雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)（LC061195） 同源性為100%。

在cox1基因位點(diǎn)，成功獲得10條蛔蟲(chóng)序列，序列一致，均與甘肅鴿源鴿蛔蟲(chóng)（JX624729） 同源性為97.9%，存在5個(gè)堿基差異，分別在801、858、936、954和1086核苷酸位置存在A→G，T→C，A→G，C→T和A→G，提示其存在種類(lèi)差異。

通過(guò)序列分析，鑒定本調(diào)查所獲蛔蟲(chóng)均為雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)。

2.3 鴿的蛔蟲(chóng)序列種系發(fā)育分析

基于SSU rDNA基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，本調(diào)查所獲鴿的蛔蟲(chóng)序列與日本雞尾鸚鵡源和我國(guó)廣東金剛鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)序列聚集在一支，與美國(guó)雞源雞蛔蟲(chóng)聚類(lèi)構(gòu)成1個(gè)亞群結(jié)構(gòu)，而與其他屬蛔蟲(chóng)形成不同的亞群分支 （圖4）。

基于nad2基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，本調(diào)查所獲鴿的蛔蟲(chóng)序列與日本雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)單獨(dú)聚類(lèi)構(gòu)成1個(gè)亞群，而與其他屬蛔蟲(chóng)形成不同的亞群分支 （圖5）。

基于cox1基因序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示，本文獲得的序列與我國(guó)甘肅鴿源鴿蛔蟲(chóng)單獨(dú)聚類(lèi)形成1個(gè)亞群（圖6）。

3 討論

蛔蟲(chóng)是鴿體內(nèi)的大型寄生線(xiàn)蟲(chóng)，時(shí)常引起群體感染，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn)行種類(lèi)鑒定通常以形態(tài)學(xué)方法對(duì)蟲(chóng)體進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征觀察，但要求觀察者是經(jīng)驗(yàn)豐富者，且步驟較為繁瑣。目前，分子生物學(xué)技術(shù)已成為寄生蟲(chóng)分類(lèi)鑒定常用方法之一。Yang等[3]基于18S rDNA基因、ITS rDNA基因和nad4基因?qū)V東的金剛鸚鵡的蛔蟲(chóng)鑒定，結(jié)果為雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng);Abe等[4]通過(guò)nad2基因?qū)?lái)源于日本雞尾鸚鵡的蛔蟲(chóng)研究發(fā)現(xiàn)，所獲得的蟲(chóng)體是與鴿蛔蟲(chóng)高度同源的雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng);李佳緣等[7]基于cox1基因?qū)?lái)源于廣東、云南、湖南的8條雞的蛔蟲(chóng)進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該位點(diǎn)雞蛔蟲(chóng)與其他蛔蟲(chóng)存在較大種間差異。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在SSU rDNA和nad2基因位點(diǎn)所獲鴿源蛔蟲(chóng)序列與日本的雞尾鸚鵡源雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)序列的同源性分別為99.9%和100%，與上述報(bào)道相一致，提示不同宿主來(lái)源和不同地理來(lái)源的雞尾鸚鵡蛔蟲(chóng)存在一定的差異。在cox1基因所獲鴿源蛔蟲(chóng)序列均與我國(guó)甘肅鴿源鴿蛔蟲(chóng)存在5個(gè)堿基差異，提示存在種類(lèi)差異，其應(yīng)該是不同的種;由于目前禽源蛔蟲(chóng)cox1基因序列尚較少，其種系進(jìn)化發(fā)育有待于進(jìn)一步分析。本研究結(jié)果為鴿源蛔蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定提供了基礎(chǔ)資料。

造成鴿蛔蟲(chóng)病的發(fā)生主要是因?yàn)轱曫B(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生差、飼料營(yíng)養(yǎng)不均衡、養(yǎng)殖技術(shù)低、防病意識(shí)差等因素，防治鴿蛔蟲(chóng)病應(yīng)做好鴿舍的清潔工作，及時(shí)清除糞便，保證飼料和飲水衛(wèi)生，選用優(yōu)質(zhì)混合料，定期驅(qū)蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)病例及時(shí)隔離治療等[8]。

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