Circ-MALAT1靶向miR-101抑制膀胱癌細胞系SW780侵襲和遷移

楊芒莊，楊旭東，王曉龍

(黃河三門峽醫院 泌尿外科, 河南 三門峽 472000)

膀胱癌(bladder cancer)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一[1]，主要發生在膀胱黏膜上，占中國泌尿生殖系腫瘤發病率的第一位，男性發病率明顯高于女性。CircRNA是一類在活體中有時也有表達特殊的非編碼RNA分子，在活體中有表達。環狀RNA(circular RNA，circRNA)分子富含微小RNA(microRNA，miRNA)結合位點，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用[2]。有研究表明，circRNA和miRNA在膀胱癌細胞中均有表達，影響膀胱癌的發生發展[3]。本實驗主要探討circ-MALAT1靶向miR-101通過PI3K/AKT信號通路影響膀胱癌侵襲和遷移的實驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 膀胱癌組織和癌旁組織來源：選取2018年3月至2019年5月在三門峽醫院進行手術治療的膀胱癌患者40例，其中男21例，女19例，年齡45～70歲。術中切除癌組織及癌旁組織，癌旁組織是指距離病灶2 cm的組織。本研究經三門峽醫院倫理委員會批準(批準號：201712034)，所有患者簽署知情同意書。

1.1.2 細胞與試劑：人膀胱移行細胞癌細胞系SW780(中國科學院上海細胞庫)；DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)；熒光定量試劑盒(TaKaRa公司)；Transwell小室、Matrigel膠(北京索萊寶生物科技有限公司)；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；一抗、二抗(北京明陽科華生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養與分組：用含10%胎牛血清DMEM培養基培養SW780，在為37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，取對數增殖期細胞進行后續實驗，將si-NC組(轉染si-NC)、si-circ-MALAT1組(轉染si-circ-MALAT1)、miR-NC組(轉染miR-NC)、miR-101組(轉染miR-101 mimics)、(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)組(共轉染si-circ-MALAT1和anti-miR-NC)、(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)組(共轉染si-circ-MALAT1和anti-miR-101)轉染至SW780細胞。

1.2.2 RT-qPCR檢測circ-MALAT1和miR-101表達水平：采用Trizol試劑提取各組細胞中的總RNA，使用分光光度計測定RNA的濃度，再用反轉錄試劑盒將RNA合成cDNA。隨后使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒進行擴增。Circ-MALAT1以GAPDH為內參，miR-101以U6為內參。采用2-ΔΔCt法計算circ-MALAT1和miR-101相對表達量。

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞侵襲和遷移：用稀釋的基質膠包被Transwell上腔室膜進行侵襲實驗。每組取1×104個細胞接種Transwell上腔室中，加入200 μL無血清培養基。24孔板下室中加入500 μL含10%胎牛血清的細胞培養基作為誘導劑。培養箱孵育24 h，棉簽除去基質膠和未過膜細胞。甲醇固定侵襲過膜的細胞，結晶紫染色15 min。顯微鏡觀察細胞，隨機選取5個視野計數采用均數表示細胞侵襲數量。遷移實驗時采用未包被基質膠的小室，其他步驟與侵襲實驗一致。

1.2.4 Western blot檢測MMP-2、MMP-9、p-PI3K、p-AKT蛋白表達：收集各組細胞，在放射免疫沉淀緩沖液裂解以提取蛋白，用BCA法定量。吸取蛋白樣品(30 μg)進行10% SDS-PAGE，并轉移到PVDF膜上。在5%脫脂牛奶封閉液中封閉膜，室溫下孵育1 h。隨后，將PVDF膜與抗MMP-2(1∶1 000)、抗MMP-9(1∶1 000)、抗p-PI3K(1∶1 000)和抗p-AKT(1∶1 000)抗體孵育過夜。之后，膜用HRP標記的IgG抗體室溫孵育1 h，通過增強化學發光試劑盒對膜進行顯影，Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗檢測circ-MALAT1對miR-101的靶向關系：使用LipofectamineTM2000轉染試劑將構建好的WT-circ-MALAT1質粒和MUT-circ-MALAT1質粒分別與miR-101 mimics和陰性對照miR-NC共轉染至SW780細胞。細胞培養48 h之后，檢測相對熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Circ-MALAT1和miR-101在癌旁組織和膀胱癌組織中的表達

與癌旁組織比較，膀胱癌組織中circ-MALAT1表達水平明顯上調(P<0.05)，miR-101表達水平明顯下調(P<0.05)(表1)。

表1 Circ-MALAT1和miR-101在癌旁組織和膀胱癌組織中的表達

2.2 抑制circ-MALAT1表達對SW780細胞侵襲和遷移的影響

與si-NC組比較，si-circ-MALAT1組中circ-MALAT1表達水平明顯下調(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數以及MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)(圖1，表2)。

表2 抑制circ-MALAT1表達對SW780細胞侵襲和遷移的影響

A.Western blot detection of protein expression; B.invasion and migration pictures

2.3 上調miR-101表達對SW780細胞侵襲和遷移的影響

與miR-NC組比較，miR-101組中miR-101表達水平明顯上調(P<0.05)，侵襲、遷移細胞數以及MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯下調(P<0.05)(圖2，表3)。

表3 上調miR-101表達對SW780細胞侵襲和遷移的影響

A.Western blot detection of protein expression; B.invasion and migration pictures

2.4 Circ-MALAT1靶向調控miR-101

Starbase數據庫預測顯示circ-MALAT1與miR-101存在結合位點(圖3)。實驗顯示，轉染野生型表達載體WT-circ-MALAT1，與miR-NC組相比，miR-101組中細胞熒光素酶活性明顯下調(P<0.05)(表4)。

表4 雙熒光素酶報告基因實驗

圖3 Circ-MALAT1與miR-101的結合位點

2.5 抑制miR-101部分逆轉沉默circ-MALAT1對SW780細胞侵襲和遷移的影響

與(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)組比較，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)組細胞侵襲、遷移細胞數以及MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯上調(P<0.05)。(圖4，表5)。

A.Western blot detection of protein expression; B.invasion and migration pictures

表5 抑制miR-101部分逆轉沉默circ-MALAT1對SW780細胞侵襲和遷移的影響

2.6 PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

與si-NC組比較，si-PVT1組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯下調(P<0.05)，與(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)組比較，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯上調(P<0.05)(圖5，表6)。

表6 PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達

圖5 Western blot檢測蛋白表達

3 討論

膀胱癌在人體內的發生發展嚴重威脅著機體的健康和安全，臨床上的治療手段主要有化學藥物治療、放射治療及手術治療，但是副作用比較大，復發率比較高，患者預后不良。膀胱癌的病理類型有很多，主要包括尿路上皮癌、膀胱鱗狀細胞癌和膀胱腺癌。該疾病嚴重威脅人類的生命和健康[4-5]。基因治療膀胱癌是一種新的治療方式，主要是通過某些基因突變的靶點進行靶向治療，治療效率高，針對腫瘤細胞作用不損傷正常組織。

本實驗研究表明，與癌旁組織比較，膀胱癌組織中circ-MALAT1表達明顯上調，miR-101表達明顯下調。已經有研究表明結果與本實驗一致，circ-MALAT1在肝癌細胞中表達水平顯著上調[6]；miR-101在膀胱癌細胞中的表達顯著下調[7]。

本實驗研究發現，與si-NC組比較，抑制circ-MALAT1表達組中circ-MALAT1表達水平明顯下調，侵襲、遷移細胞數明顯下調。與miR-NC組比較，過表達miR-101后，侵襲、遷移細胞數明顯下調。與(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)組比較，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)組細胞侵襲、遷移細胞數明顯上調。已有有類似的報道與本實驗研究結果一致。Circ-ITCH通過調控miR-17或 miR-224表達來抑制膀胱癌的發展[8]。Circ-BCRC-3通過miR-182-5p或者p27軸抑制膀胱癌的增殖[9]。CircUBXN7通過海靶向miR-1247-3p增強膀胱癌中B4GALT3的表達來抑制細胞增殖和侵襲[10]。下調hsa_circ_0000144通過刺激miR-217和抑制RUNX2表達來抑制膀胱癌的進展[11]。通過靶向miR-223或成纖維細胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2)軸來沉默circ-UVRAG抑制膀胱癌的生長和轉移[12]。

P13K/AKT信號傳導通路在惡性腫瘤的發生，發展，治療及轉歸中發揮著重要作用，對腫瘤細胞的增殖和凋亡起非常重要的調節作用。P13K/AKT信號通路在膀胱癌的發生發展中發揮著極其重要的作用[13-15]。本實驗表明，與si-NC組比較，si-PVT1組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯下調，與(si-circ-MALAT1+anti-miR-NC)組比較，(si-circ-MALAT1+anti-miR-101)組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯上調。說明干擾circ-MALAT1表達，上調miR-101表達，通過抑制PI3K/AKT信號通路，從而抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，抑制circ-MALAT1表達并上調miR-101抑制膀胱癌細胞的侵襲和遷移，其機制與PI3K/AKT信號通路有關。研究結果為膀胱癌的治療提供理論基礎。