匹伐他汀對合并脂代謝異常的穩定型冠心病患者HDL-C水平及功能的影響

王會娟，王繼紅，趙興山，劉 巍

(北京積水潭醫院 心內科，北京 100096)

高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平與冠狀動脈疾病的發病風險呈一種顯著的負相關趨勢，即使在強化他汀(statins)治療使LDL-C達標后，這種負相關作用依然存在[1]。HDL-C發揮心血管保護作用的主要機制為膽固醇的逆轉運(reverse cholesterol transport RCT)，即將周圍血管壁巨噬細胞中的膽固醇轉運至肝臟，從而排出體外的過程[2]。此外，HDL-C還具有抗氧化、抗感染、抗凋亡、抗栓等多種抗動脈粥樣硬化作用[3]。他汀類藥物均具有顯著降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平的作用，但升高HDL-C水平的作用卻存在很大差異。目前的多項研究顯示，與其他類型的他汀類藥物相比，匹伐他汀(pitavastatin)升高HDL-C的作用更為顯著[4]。但關于匹伐他汀對HDL-C功能的研究卻鮮有報道?；谏鲜鲅芯楷F狀，本研究通過檢測匹伐他汀對HDL-C膽固醇外流功能以及抗氧化因子對氧磷酶1(paraoxonase-1, PON-1)的影響，從而探索匹伐他汀的多效性抗動脈粥樣硬化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取2018年1月至2020年1月就診于北京積水潭醫院心內科門診及病房的合并脂代謝異常的穩定型冠心病患者60例，納入標準包括：1)經冠狀動脈造影證實或既往存在心肌梗死病史的穩定型冠心病患者；2)年齡≥18歲;排除標準：1)肝、腎功能異常者；2)甲狀腺疾病及甲狀腺藥物應用史；3)妊娠；4)嚴重心力衰竭、感染、電解質紊亂。上述所有患者簽署知情同意書,經北京積水潭醫院倫理委員會批準(批準號：201803-05)。符合上述標準的受試者隨機分為兩組，一組予以匹伐他汀(pitavastatin)2～4 mg/d，另一組予以阿托伐他汀(atorvastatin)10～20 mg/d，觀察治療6個月，調整他汀劑量使LDL-C達標(<70 mg/dL)。

1.1.2 試劑與細胞：胎牛血清、RPMI1640培養基(Gibco公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司); Trizol(TaKaRa公司);qPCR檢測試劑盒(DBI公司)；3H-膽固醇油酸酯(GE公司)；20%的聚乙二醇、對氧磷、苯乙酸酯(Sigma-Aldrich公司)；急性單核細胞白血病細胞系THP-1(由中國醫學科學院基礎所免疫學系免疫學實驗室友情提供)。

1.2 方法

1.2.1 脂代謝指標的檢測:分別于治療前、治療后6個月抽取外周靜脈血10 mL，應用濕化學法進行各項脂代謝指標檢測，包括：LDL-C、HDL-C、TG、apoA-1和apoB等。

1.2.2 細胞的培養: THP-1細胞在含有20%胎牛血清(FBS)與100 μg/mL青鏈霉素的RPMI-1640培養基中培養，經0.4 μmol/L的PMA孵化48 h分化為巨噬細胞，用油紅O染色及CD68免疫組化染色鑒定巨噬細胞。

1.2.3 聚乙二醇(PEG)-HDL的制備:血清標本與20%的PEG溶液按100∶40的比例混合，在200 mmol/L的甘氨酸緩沖液中在室溫下共同孵育15 min，4 000 r/min離心20 min,使含有apoB的脂蛋白沉淀，獲得上清液(PEG-HDL)備用。

1.2.4 膽固醇外流率的測定:THP-1巨噬細胞加入3.7×104Bq/mL[1 ci(居里)=3.7×1010Bq(貝可勒爾)]的3H膽固醇孵育液，37 ℃孵育24 h，同步化2 h，分別以PEG-HDL、apoA1及自身血清為接受體，觀察膽固醇外流率的變化。具體方法如文獻[5]所述。

1.2.5 氧磷酸1(PON-1)活性的測定：以PEG-HDL作為HDL相關性PON-1活性酶測定的反應物，以對氧磷和苯乙酸酯為底物，用分光光度法檢測對氧磷酶與芳基酯酶兩種酶活性。具體方法如下：對氧磷酶活性測定：應用對氧磷作為底物，以100 mmol/L Tris-Cl緩沖液(pH 8.5)建立200 μL的分析體系，包含2 mol/L NaCl和2 mmol/L CaCl2，1.2 mmol/L對氧磷，加入20 μL PEG-HDL。在25 ℃下，利用酶標儀在405 nm處連續掃描記錄5 min內產物生成速率。酶活性以μmol/(min·L)表示 1個PON-1酶活性單位值(U)。芳基酯酶活性測定：通過苯乙酸酯水解為苯酚的速率來進行測定，以20 mmol/L Tris緩沖液制成200 μL體系，包括：5 μL PEG-HDL樣品，1 mmol/L苯乙酸酯，0.9 mmol/L Cacl2(pH 8.0)。上述反應在37 ℃下，用酶標儀在260 nm處連續掃描5 min。酶活性以μmol/(min·L)表示1個PON-1活性單位。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 兩組患者治療前后血脂水平變化比較

兩組患者基線資料差異無統計學意義。治療后，兩組患者的LDL-C水平均有顯著下降(P<0.05)。HDL-C水平在匹伐他汀組治療后較治療前升高了9.0%，而阿托伐他汀組僅升高了1.8%(表1)。

表1 治療前后血脂水平比較

2.2 膽固醇外流率變化

2.2.1 PEG-HDL介導的膽固醇外流率：PEG-HDL介導的膽固醇外流率在匹伐他汀組治療后較治療前顯著增加(P<0.001)，而阿托伐他汀組治療前后則差異無統計學意義(圖1A)。

2.2.2 ApoA1及自身血清介導的膽固醇外流：兩組患者治療前后apoA1介導的膽固醇外流率差異均無顯著性(圖1B)。自身血清介導的膽固醇外流率在匹伐他汀治療后較治療前顯著增加(P<0.01)；而阿托伐他汀治療前后差異則無顯著性(圖1C)。

A.cholestrol efflux to PEG-HDL before and after statin treatment; B.cholestrol efflux to apoA1 before and after statin treatment; C.cholestrol efflux to auto-serum before and after statin treatment; *P<0.01 compared with pre-treatment

2.3 氧磷酶1(PON-1)酶活性水平的變化

PON-1酶活性水平(包括對氧磷酶和芳基酯酶)治療前后在匹伐他汀和阿托伐他汀兩組中均有顯著升高。匹伐他汀組，對氧磷酶和芳基酯酶活性水平較治療前分別增加了21%和18%(P<0.001)；阿托伐他汀治療組，對氧磷酶和芳基酯酶活性分別增加了24%和17%(P<0.001)(圖2)。

A.paraoronase activity of pre-and post-statin treatment; B.arylesterase activity of pre-and post-statin treatment;*P<0.001 compared with pre-treatment

3 討論

本研究在合并脂代謝異常的穩定型冠心病患者中觀察到，匹伐他汀可使患者HDL-C水平顯著升高，而阿托伐他汀治療對HDL-C水平則無顯著影響，這與之前的研究結果相一致[6]。匹伐他汀具有更廣的降脂作用譜(不僅作用于含apoB的脂蛋白，還作用于含apoA的脂蛋白)，能夠刺激肝細胞apoA1的合成與分泌，從而導致HDL-C合成增加[7]。此外，匹伐他汀可通過誘導肝細胞ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1 ABCA1)的表達，使肝細胞內膽固醇外流至apoA1,從而使HDL-C合成增加[8]。

盡管大量研究結果顯示血漿 HDL-C水平與冠心病發病風險呈負相關，但HDL是一類異質性脂蛋白，不同HDL亞組分的組成、形狀大小、密度、電荷和抗動脈粥樣硬化特性等方面均不相同[9]，因此近年的研究認為，除了HDL-C水平檢測，針對HDL功能的評價指標將對冠心病的風險評估具有更重要的價值。本研究在觀察到匹伐他汀升高HDL-C的基礎上進一步探索了HDL-C功能的變化。結果發現，匹伐他汀治療6個月使HDL介導的膽固醇外流率顯著增加，同時，作為HDL-C相關的抗氧化因子PON-1活性水平也存在顯著升高。

膽固醇逆轉運是HDL-C發揮抗動脈粥樣硬化作用最重要的機制之一。在膽固醇逆轉運過程中，膽固醇外流是其中的限速步驟，多種轉運蛋白及分子參與了這個復雜的過程。本研究發現HDL介導的膽固醇外流率在匹伐他汀治療組顯著增高，提示匹伐他汀升高HDL-C水平的同時，使HDL-C的膽固醇外流功能得到改善，這與之前的研究結果是一致的[10]。

除了膽固醇外流功能外，抗氧化功能是HDL-C的另一項重要的抗動脈粥樣硬化機制。PON1是循環中與HDL緊密結合的一種鈣依賴性酯酶，是HDL抗氧化活性的最重要的成分之一。PON-1具有對氧磷酶活性，通過抑制LDL的氧化修飾發揮抗氧化作用，此外，PON-1還具有磷脂酶活性，通過水解氧化磷脂(致炎因子)，使細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達水平下降，從而發揮抗炎作用[11]。與之前的研究相一致，本研究發現，無論是匹伐他汀還是阿托伐他汀，均可導致PON-1水平增高，而這一HDL-C相關性的抗氧化作用可能是他汀類藥物的類效應[12]。

綜上所述，匹伐他汀治療不僅能使HDL-C水平升高，而且使HDL-C的膽固醇外流功能及抗氧化功能也得到保留和改善。本研究也存在一定局限與不足，樣本量偏小，治療時間相對較短，研究結果還需要為更多的研究所證實。