羅哌卡因抑制人肝癌細胞系Hep3B增殖、遷移和侵襲

孫全鵬，樊 超，展德璽，范怡明，孫偉峰

(1.鄭州大學第一附屬醫院 麻醉科, 河南 鄭州 450044；2.鄭州市骨科醫院 麻醉科, 河南 鄭州 450044；3.鄲城縣人民醫院 麻醉科, 河南 周口 477150)

外科手術是肝癌和其他實體腫瘤的主要治療手段[1]。然而，手術切除本身可能導致癌細胞進入血液循環促進腫瘤擴散，同時圍手術期全麻藥和阿片類藥物的使用可抑制機體免疫應答，促進癌細胞的擴散和轉移[2]。回顧性分析表明，局部麻醉可降低癌術后復發風險，提高患者生存率[3]。羅哌卡因(ropivacaine)是一種新型酰胺類局麻藥，其通過阻斷神經興奮與傳導，具有廣泛的鎮痛和治療功能。最近研究表明，羅哌卡因可抑制肝癌細胞活力和遷移能力，破壞線粒體功能，誘導細胞凋亡[4]。然而，其抗腫瘤作用機制并未完全闡明。長基因間非編碼RNA 00853(long intergene non-coding RNA 00853，LINC00853)是一種新型RNA轉錄本，肝癌組織中LINC00853表達增加，且血清和細胞外囊泡衍生的LINC00853是肝癌潛在的新型診斷標志物[5]。然而，LINC00853在肝癌進展中的作用鮮有研究。本研究以LINC00853為切入點，從細胞增殖、遷移侵襲角度探討羅哌卡因在肝癌中的抗腫瘤作用，為羅哌卡因在肝癌患者圍手術期麻醉中的應用提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽酸羅哌卡因注射液(AstraZeneca AB公司)；人肝癌細胞系Hep3B(中科院上海細胞研究所)；細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(日本同仁生物公司)；所有序列片段、質粒(廣州銳博生物公司)；Transwell小室(美國密理博公司)；反轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(北京寶日醫生物技術有限公司)；兔源增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)單抗、兔源基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)單抗和兔源MMP9單抗、羊抗兔IgG二抗(上海艾博抗生物公司)

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組和處理：Hep3B細胞用含10%胎牛血清的高糖杜爾比格伊戈爾培養基(DMEM)放入含5% CO2、37 ℃、無菌恒溫培養中培養。消化80%匯合的Hep3B細胞，按照1∶5稀釋轉移至新的培養皿中，每周換液2次。用含0、100、200、400和800 μmol/L羅哌卡因的培養基分別孵育對數期Hep3B細胞48 h，確定羅哌卡因使用濃度(400 μmol/L)。將Hep3B細胞分為對照(不做處理)組、羅哌卡因(400 μmol/L羅哌卡因孵育48 h)組、si-NC組(轉染si-NC)、si-LINC00853組(轉染si-LINC00853)、pcDNA-NC組(轉染pcDNA-NC)、pcDNA-LINC00853組(轉染pcDNA-LINC00853)、(羅哌卡因+pcDNA-NC)組(用含400 μmol/L羅哌卡因的培養液孵育轉染pcDNA-NC的Hep3B細胞48 h)、(羅哌卡因+ pcDNA-LINC00853)組(用含400 μmol/L羅哌卡因的培養液孵育轉染pcDNA-LINC00853的Hep3B細胞48 h)。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖：將未轉染的Hep3B細胞接種96孔板，貼壁后用羅哌卡因終濃度為0、100、200、400和800 μmol/L培養基(100 μL/孔)孵育細胞48 h。將轉染si-NC、si-LINC00853、pcDNA-NC或pcDNA-LINC00853的Hep3B細胞接種96孔板，培養48 h。將轉染pcDNA-NC或pcDNA-LINC00853的Hep3B細胞接種96孔板，貼壁后用羅哌卡因終濃度為400 μmol/L培養基(100 μL/孔)孵育48 h。設置3個復孔。每孔加入CCK-8溶液10 μL，繼續培養2 h，酶標儀在450 nm處測量吸光度(A)值。增殖抑制率=(1-A實驗組/A對照組)×100%

1.2.3 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲：每組取200 μL細胞懸液(細胞數約為1×104，不含胎牛血清)接種涂有基質膠(檢測侵襲)或未涂基質膠(檢測遷移)的Transwell小室中；將500 μL培養基(含有20%胎牛血清)加入到24孔板下室作為誘導劑。將Transwell小室至于培養箱中孵育24 h后，去除Transwell膜上表面的基質膠和細胞，甲醇固定Transwell膜下表面細胞30 min，結晶紫染色20 min。倒置顯微鏡下計數，以5個視野的均值表示侵襲或遷移細胞數。

1.2.4 RT-qPCR檢測LINC00853表達：按照Trizol試劑盒步驟提取總RNA，利用反轉錄試劑盒將1 μg RNA反轉錄成cDNA。利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和下述引物說明進行RT-qPCR反應。以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算LINC00853相對表達量。引物序列如下：LINC00853上游5′-AAAGGCTAGGCGATC CCACA-3′，下游5′-ACTCCCTAGCTTGGCTCTCCT-3′；β-actin上游5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTA CGA-3′，下游5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAAT GG-3′。

1.2.5 Western bolt檢測PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達：用RIPA緩沖液裂解各組細胞。每泳道40 μg蛋白樣品，行SDS-PAGE，并在恒定電流下轉膜。封閉膜后，加入兔源PCNA、MMP2和MMP9抗體(均為1∶2 000稀釋)4 ℃孵育12 h。用二抗(1∶2 500 稀釋)室溫下孵育膜2 h。增強型化學發光試劑暗室顯影，Image J軟件分析PCNA、MMP2和MMP9蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 羅哌卡因對Hep3B細胞增殖的影響

相較于對照組，羅哌卡因處理后Hep3B細胞增殖抑制率顯著升高，PCNA蛋白表達顯著降低(P<0.05)，且表現出一定的濃度依賴性(圖1，表1)。選擇增殖抑制率約為50%的羅哌卡因濃度(400 μmol/L)進行后續實驗。

圖1 Western blot檢測PCNA蛋白的表達

表1 羅哌卡因對Hep3B細胞增殖和PCNA蛋白表達的影響

2.2 羅哌卡因對Hep3B細胞遷移和侵襲以及蛋白表達的影響

與對照組比較，羅哌卡因組Hep3B細胞遷移和侵襲數量、MMP2和MMP9蛋白表達顯著降低(P<0.05)(圖2，表2)。

A.cell migration and invasion were detected by Transwell assay(×200); B.MMP2 and MMP9 protein expressions were detected by Western blot

表2 羅哌卡因對Hep3B細胞遷移和侵襲以及蛋白表達的影響

2.3 羅哌卡因對LINC00853表達的影響

與對照組比較，羅哌卡因組Hep3B細胞LINC00853表達為0.35±0.03顯著低于對照組的1.00±0.11(P<0.05)。

2.4 LINC00853對Hep3B細胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達的影響

與si-NC組比較，si-LINC00853組Hep3B細胞LINC00853表達水平以及PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表達顯著降低，遷移和侵襲細胞數顯著減少，增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-NC組比較，pcDNA-LINC00853組Hep3B細胞LINC00853表達水平、以及PCNA、MMP2和MMP9蛋白的表達顯著升高，遷移和侵襲細胞數顯著增加，增殖抑制率顯著降低(P<0.05)(圖3，表3)。

表3 LINC00853對Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖3 Western blot檢測PCNA、MMP2和MMP9蛋白在Hep3細胞中的表達

2.5 LINC00853高表達可以降低羅哌卡因對Hep3B細胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達的影響

與(羅哌卡因+pcDNA-NC)組比較，(羅哌卡因+pcDNA-LINC00853)組Hep3B細胞LINC00853表達水平顯著升高，增殖抑制率顯著降低，遷移和侵襲細胞數、PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達顯著升高(P<0.05)(表4，圖4)。

表4 LINC00853高表達可以逆轉羅哌卡因對Hep3B細胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達的影響

圖4 Western blot檢測PCNA、MMP2和MMP9蛋白在Hep3B細胞中的表達

3 討論

羅哌卡因通過調控細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲、耐藥在多種人腫瘤中具有抗腫瘤作用。臨床相關濃度羅哌卡因通過抑制細胞外信號調節激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)磷酸化可降低胃癌細胞HGC-27的增殖和遷移能力，但對細胞侵襲影響的大小無統計學意義[6]。羅哌卡因以劑量依賴性方式抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的遷移和侵襲，加速細胞凋亡[7]。此外，羅哌卡因還可增強5-氟嘧啶和紫杉醇對食管癌細胞的抗增殖和促凋亡作用[8]。本研究表明羅哌卡因以劑量依賴方式抑制肝癌細胞Hep3B增殖能力。進一步研究發現，約50%增殖抑制率時羅哌卡因濃度還可顯著降低Hep3B細胞的遷移和侵襲能力。PCNA是一種細胞核非組蛋白，其參與DNA合成、復制和修復，是細胞增殖的重要標志，下調PCNA表達可降低肝癌細胞的增殖能力[9]。MMP2和MMP9通過降解細胞外基質和基底膜介導腫瘤細胞侵襲和轉移[10]。本研究中，羅哌卡因明顯下調PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達，這進一步說明羅哌卡因對Hep3B細胞具有增殖、遷移和侵襲抑制作用，與報道[4]一致。

LncRNA通常定義為長于200個核苷酸且缺乏蛋白編碼功能的RNA分子，其通過影響表觀遺傳、轉錄或轉錄后調控參與細胞增殖、凋亡、代謝、遷移和侵襲等多種細胞生物學過程[11]。利多卡因通過上調lncRNA人母系表達基因3(maternal expression gene 3，MEG3)表達可抑制宮頸癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[12]。本研究中發現，羅哌卡因處理后Hep3B細胞中LINC00853表達水平顯著降低，提示羅哌卡因的抗腫瘤作用與調控LINC00853表達有關。進一步研究顯示，下調LINC00853表達可顯著降低Hep3B細胞的增殖、遷移和侵襲能力，下調PCNA、MMP2和MMP9蛋白表達水平，而上調LINC00853具有相反作用，提示LINC00853在肝癌中具有致癌作用。此外，上調LINC00853表達還可部分減弱羅哌卡因對Hep3B細胞增殖、遷移、侵襲以及相關蛋白表達的影響，這提示下調LINC00853表達可能是羅哌卡因在肝癌中發揮抗腫瘤作用的重要機制。然而，是否存在其他lncRNA介導羅哌卡因的抗肝癌作用仍有待研究。

總之，本研究證實羅哌卡因可抑制肝癌細胞Hep3B的增殖、遷移和侵襲，其機制可能與下調LINC00853表達有關，這豐富了羅哌卡因的抗腫瘤作用機制，為羅哌卡因在肝癌患者圍手術期麻醉中的應用提供了實驗依據。