草莓果實病原菌的分離鑒定及對12種殺菌劑的敏感性

姜莉莉，王欽超，宗曉娟，王曉芳，田中一久，武沖

（1.山東省果樹研究所／山東省現代設施果樹技術創新中心，山東 泰安 271000；2.龍口省級農業高新技術產業開發區管委會，山東 龍口 265701）

草莓（Fragaria ananasaDuch）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實味美多汁、口感上佳，且富含維生素、花色苷等多種營養成分，深受消費者喜愛［1］。由于草莓果皮薄、果肉組織柔軟，在采摘和采后貯運過程中極易受到擦碰，導致病原菌侵染而迅速腐爛，造成巨大經濟損失［2］。

草莓含水量較高，易促使微生物生長繁殖。微生物是影響草莓貯存期的重要因素，因此抑制微生物的生長是提高草莓保鮮效果、延長貨架期的必要條件，也是草莓采后產業迫切需要解決的問題［3］。本研究從‘章姬’草莓的腐敗果實中分離病原菌，進行菌種鑒定，并通過測定室內毒力評價其對12種殺菌劑的敏感性，篩選得到高效殺菌劑，以期為草莓果實病害科學防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021年5月3日，在山東省果樹研究所金牛山試驗基地草莓大棚采集無腐爛、無病蟲害、無機械損傷的近成熟‘章姬’草莓果實，置于無菌保鮮盒內，室溫放置。待果實自然腐爛后，進行病原菌分離。

1.2 供試藥劑

98%咪鮮胺原藥、97%氟環唑原藥，安道麥輝豐（江蘇）有限公司；95%咯菌腈原藥、96%啶酰菌胺原藥、95%己唑醇原藥、95%氟硅唑原藥，山東濰坊潤豐化工股份有限公司；96%氟吡菌酰胺原藥，拜耳股份公司；98%肟菌酯、94%腈菌唑原藥、97%苯醚甲環唑原藥、98%噻呋酰胺原藥、96%嘧菌酯原藥，山東省聯合農藥工業有限公司。

氟硅唑原藥以環己酮溶解，其它原藥以丙酮溶解，制備濃度為1%的母液，于4℃保存備用。

1.3 病原菌的分離純化

采用病組織分離法［4］，在腐敗草莓果實的病健交界處切取組織小塊，75%酒精浸泡30 s后，以無菌水沖洗3次，接種于PDA培養基上，25℃黑暗培養3～5 d。待菌落形成后，在菌落邊緣挑取菌絲接種于新的PDA培養基上，進行純化。

1.4 病原菌鑒定

將純化后的菌株接種于PDA培養基，25℃黑暗培養7 d，觀察菌落形態；繼續培養至產孢后，采用光學顯微鏡觀察孢子形態。

根據柯赫氏法則進行病原菌致病力測定［5］。選擇健康無傷口的草莓果實表面消毒后，置于濃度約為1×105個／mL的病原菌孢子懸浮液中浸泡30 s后取出，瀝干水分，置于保鮮盒中，室溫存放，記錄病害癥狀。

以真菌全基因組DNA提取試劑盒提取菌絲基因組DNA，以ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）為引物進行PCR擴增［6］。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果在NCBI數據庫進行BLAST比對，并采用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹［7］。

1.5 殺菌劑室內毒力測定

采用生長速率法測定12種殺菌劑對病原菌的室內毒力［8］。在預試驗確定試驗濃度范圍的基礎上，對供試藥劑母液進行梯度稀釋。其中咪鮮胺濃度為0.125、0.25、0.50、1.25、2.50 mg／L，咯菌腈、啶酰菌胺和氟吡菌酰胺濃度為0.25、0.50、1.25、2.50、5.00 mg／L，其余藥劑濃度為0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 mg／L。

在超凈工作臺上，采用移液器吸取1 mL各濃度藥液，加入49 mL滅菌后冷卻至50～60℃的PDA培養基中，充分搖勻后倒板，制成含藥PDA平板，每個濃度3次重復。在活化好的菌落邊緣，以直徑7 mm的打孔器打取菌餅，菌絲朝下接種于含藥PDA平板中央。以無菌水處理為對照，25℃黑暗培養5～7 d。待對照組菌落長至培養皿1／2以上時，以十字交叉法測定菌落直徑［9］，計算各濃度藥液對菌絲生長的抑制率。采用SPSS 18.0計算毒力回歸方程和EC50值。以EC50值最高的藥劑為基準，計算其它藥劑的相對毒力指數，比較病原菌對12種供試藥劑的敏感性差異。

抑制率（%）＝（對照組菌落直徑－處理組菌落直徑）／（對照組菌落直徑－菌餅直徑）×100。

2 結果與分析

2.1 病原菌鑒定

從自然腐敗的草莓果實上分離得到多株病原菌，選取具有代表性的菌株CH－4進行鑒定。在PDA平板上培養5 d后，菌落圓形，深棕色至褐色，菌絲致密，氣生菌絲較少（圖1）。分生孢子呈棒槌形，有縱橫分隔，分割處有縊縮（圖2）。

圖1 CH－4菌株的菌落形態

圖2 CH－4菌株的分生孢子

病原菌孢子懸浮液接種至健康草莓果實2 d后出現腐敗癥狀，與原發病癥狀相同（圖3）。

圖3 CH－4菌株回接癥狀

采用ITS1／ITS4通用引物對菌株rDNA－ITS序列進行PCR擴增，得到長度為543 bp的DNA序列。通過NCBI數據庫進行BLAST比對發現，其與枝孢屬（Cladosporium）相似度最高。通過構建系統發育樹發現，該菌株與多主枝孢菌（Cladosporium herbarum）的親緣關系最近，結合形態學特征，將其鑒定為多主枝孢菌。

2.2 12種供試殺菌劑對多主枝孢菌的抑制率

由表1可以看出，咪鮮胺對多主枝孢菌的抑制作用最高，濃度為0.125～2.50 mg／L時抑制率為18.40%～96.79%；其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺，濃度為0.25～5.00 mg／L時，抑制率分別為26.06%～92.58%、22.53%～86.20%和16.61%～90.62%。己唑醇、腈菌唑和氟硅唑的作用效果也較好，濃度為0.50～10.00 mg／L時，抑制率分別為25.13%～93.87%、31.27%～81.28%和20.64%～92.41%。肟菌酯、噻呋酰胺、嘧菌酯、苯醚甲環唑和氟環唑的抑制活性較低，濃度為0.50～10.00 mg／L時，抑制率分別為11.52%～91.98%、11.02%～80.82%、7.70%～80.14%、13.80%～75.61%和15.44%～71.55%。

表1 （續）

圖4 病原菌ITS序列系統發育樹

表1 12種殺菌劑對草莓果實多主枝孢菌菌絲生長的抑制率

2.3 12種殺菌劑對多主枝孢菌的室內毒力

由表2可以看出，多主枝孢菌對咪鮮胺的敏感性最高，EC50值為0.341 mg／L，相較于氟環唑（EC50值＝3.621）的相對毒力指數為10.62。其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺，EC50值分別為0.672、0.769、0.884 mg／L，相對毒力指數分別為5.39、4.71和4.10。己唑醇、腈菌唑和氟硅唑的抑菌活性也較高，EC50值分別為1.243、1.457、1.603 mg／L，相對毒力指數分別為2.91、2.49和2.26。肟菌酯、噻呋酰胺、嘧菌酯和苯醚甲環唑的抑制活性較低，EC50值分別為2.025、2.649、3.043和3.432，相對毒力指數分別為1.79、1.37、1.19和1.06。

表2 12種殺菌劑對草莓果實多主枝孢菌菌絲生長的室內毒力

3 討論與結論

草莓屬非呼吸躍變型漿果，果實成熟后呼吸旺盛、采收后失重較快，在采摘、貯運和銷售過程中極易遭受微生物侵染而導致果肉腐敗，縮短貨架期［10］。抑制果實表面微生物的增殖是草莓采后保鮮領域的重要任務之一［11］。短波紫外線（UV－C）輻照處理能夠有效控制草莓果實貯藏期間病害的發生［12］，但儀器使用成本較高，尚不能推廣普及。近年來生物保鮮劑越來越受到關注，包括天然的或利用生物工程技術改造而獲得的生物產品，如植物精油等［13］，但其研究和開發尚處于起步階段［14］。

本研究從自然腐敗的草莓果實中分離鑒定出1株多主枝孢菌，與甘瑾等［15］的結果一致。魏超等［16］報道，枝孢菌屬真菌更易引起草莓軟腐。通過室內毒力測定發現，分離得到的多主枝孢菌對咪鮮胺的敏感性最高，其次為咯菌腈、氟吡菌酰胺和啶酰菌胺。中國農藥信息網顯示，以上4種殺菌劑均已在草莓上獲得登記，其中450 g／L咪鮮胺水劑已登記可用于浸果處理，咯菌腈和氟吡菌酰胺在草莓上的安全間隔期為3 d，啶酰菌胺在草莓上的安全間隔期為7 d。

農藥的安全間隔期是指施用后至農藥殘留量降低到最大允許殘留量所需要的間隔時間［17］。安全間隔期越短，果品安全性越高。綜合比較12種供試殺菌劑的抑菌活性和安全間隔期，我們認為防治草莓果實采后多主枝孢菌優先選擇咪鮮胺采前噴施或采后浸果，其次為咯菌腈和氟吡菌酰胺采前不少于3 d噴施。