蘋果砧木M9T337不同部位內生固氮菌群分析

張宏雁，張俊忠，張東華，閆向楠，劉麗

（西南林業大學生物多樣性保護學院，云南 昆明 650224）

蘋果是世界四大水果之一，隸屬于薔薇科（Rosaceae）蘋果亞科（Maloideae）蘋果屬（Malus），原產于歐洲、中亞和中國新疆西部，經數代人的栽培嫁接，相繼引種，現已廣泛種植。21世紀以來，中國蘋果產業較快發展，蘋果栽培面積、總產量、人均占有量與出口量均居世界第一，已經成為世界上最大的蘋果生產國和消費國［1］。目前，矮化密植栽培是蘋果生產的主流栽培模式，應用矮化砧木是實現蘋果矮化栽培的主要途徑之一，也是現代蘋果產業發展的重要標志［2］。M9T337作為生產中重要的蘋果矮化砧木，具有比其它砧木更好的苗圃性狀，不僅壓條易繁殖，而且苗木生長整齊，容易生長出二次枝，在果業產業發達的國家一般選擇利用該砧木［3］。研究表明M9T337作為砧木可影響品種對氮元素的吸收和利用［4］，還可以提高富士蘋果果實中氮、磷、鉀等元素的質量分數［5］。

在自然界中，植物與微生物密切相關，微生物能夠幫助植物抵抗病原體和環境的脅迫［6］。植物內生固氮微生物是指能夠定殖在植物體內、與宿主植物聯合固氮且對宿主無害的微生物［7］，其占據著植物組織內有利于營養供應和微環境適宜的生態位，能避免化合態氮的抑制及土著微生物的競爭［8］，幾乎可以在宿主植物的各種營養器官內發揮固氮作用，為植物提供無機氮源，而不會引起宿主任何不良反應［9］。另外，內生固氮菌在促進植物生長、增強植株抗病性和抗逆性等方面同樣具有重要作用［10，11］。相對于傳統化學氮肥，微生物固氮菌肥效率高、污染小，是一種環境友好型生物肥料，對改良土壤環境、提高作物產量均有重要的經濟和社會效益［12］。掌握植物自身的促生內生固氮菌的分布規律是合理開發使用微生物肥料的前提。

目前已在一些糧食作物如水稻［13］、玉米［14］和經濟作物甘蔗［8］等中驗證了內生固氮菌的存在，但對于非固氮樹種的內生固氮菌研究較少。中國近年來才逐步開展對非固氮樹種的固氮研究，迄今為止尚無關于果樹內生固氮菌相關研究的報道。

高通量測序技術是一項不依賴于傳統微生物培養的生物技術，廣泛應用于不同環境中的微生物群落研究［15］。高通量測序的分子標記主要是16SrRNA的V3－V4序列或ITS序列等細菌、真菌的鑒別性基因，近年來逐漸發展起來一些AOA、AOB、NifH等功能基因，其中NifH基因是所有固氮微生物含有的最保守的功能基因，在進化上與16SrRNA基因有較高的相關性，常被作為固氮微生物多樣性分析及物種分類的標準。本研究旨在應用高通量測序技術，分析蘋果砧木M9T337不同部位內生固氮菌群落結構和多樣性特征，以期為蘋果砧木M9T337內生固氮菌的開發利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

兩年生蘋果矮化自根砧木M9T337的根、枝、葉，于2019年7月采自西南林業大學樹木園，每個組織部位取4個重復，共計12個樣本。樣本均采自無明顯病蟲害、生長健康的植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本基因組DNA提取 取蘋果砧木M9T337根（G）、枝（Z）、葉（Y）各3 g，先用流水沖洗10 min，再使用70%乙醇、0.1%升汞、無菌水依次洗滌。其中，70%乙醇浸泡60 s，0.1%升汞分別處理根、枝、葉20、10、3 min，無菌水沖洗4次。采用稀釋涂布法將最后一次沖洗的無菌水涂布于NA培養基中，30℃培養2 d，以在NA培養基上無菌生長為消毒合格。經表面消毒后的根、枝、葉作為下一步試驗樣本，采用DNA提取試劑盒Fast DNA Spin Kit for Soil（MP Biomedicals公司）進行基因組DNA提取，具體方法參考試劑盒說明書。

1.2.2 內生固氮菌NifH基因的PCR擴增 以提取的植物總DNA為模板，采用NifH基因通用引物進行擴增，擴增片段長度330 bp。引物序列為POLF：5′-TGCGAYCCSAARGCBGACTC-3′；POLR：5′-ATSGCCATCATYTCRCCGGA-3′［16］。PCR擴 增 體系：DNA模板2μL，POLF 1μL，POLR 1μL，Mix 25μL，ddH2O 21μL；PCR反應條件：98℃2 min；98℃15 s，55℃30 s，72℃30 s，30個循環；72℃5 min。PCR產物回收（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads）后用熒光定量系統（Quant－iT PicoGreen ds-DNA Assay Kit）進行檢測，隨后由昆明漢嶺生物科技有限公司使用Illumina Miseq測序平臺進行序列測定。

1.2.3 生物信息學分析 通過Miseq測序得到雙端序列數據，首先根據PE之間的重疊關系，利用FLASH軟件拼接、QIIME軟件過濾、UCHIME去除嵌合體后，得到有效優化序列。然后利用UP－ARSE算法對優化序列在97%水平上進行OTU聚類分析，挑選出OTU代表性序列，并利用Greengene和Silva等數據庫進行物種注釋，去除注釋為葉綠體、線粒體及非細菌界的OTU。通過對OTU進行Alpha多樣性、Beta多樣性、物種差異和群落組成分析等得到蘋果砧木M9T337不同部位內生固氮菌群落結構組成及多樣性特征。

2 結果與分析

2.1 M9T337不同部位測序結果的質量分析

通過對蘋果砧木M9T337根、枝、葉部位進行Illumina Miseq高通量測序，分別獲得1707754、1496676、1691076條原始序列，對原始序列進行質控過濾，優化后分別得到1468598、1311182、1464006條去除嵌合體后的高質量序列。按97%相似度的分類水平劃分分類單元，并按最小樣本序列數進行抽平，通過對抽平后的ASVOTU表格進行統計，根、枝、葉部位分別獲得793、333、674個OTU。

Observed OTU指數是反映樣本中微生物多樣性的指數，利用各樣本測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，可以反映各樣本在不同測序深度時的微生物多樣性。結果（圖1）表明，隨著測序深度的增加，各部位樣本的稀疏曲線斜率趨于平滑，說明本次測序數據合理，樣本Alpha多樣性指標達到穩定，繼續增加測序深度對樣本信息貢獻量小。

圖1 基于Observed OTU指數構建的稀疏曲線

2.2 M9T337不同部位內生固氮菌Alpha多樣性分析

Alpha多樣性分析包括一系列統計學指數。以Chao1和Observed species指數表征豐富度，以Shannon和Simpson指數表征多樣性，以Pielou指數表征均勻度，以Goods coverage指數表征覆蓋度。

通過Kruskal－Wallis秩和檢驗，驗證Alpha多樣性差異的顯著性，結果見圖2。M9T337根、枝和葉部樣本的覆蓋度較高（＞99.9%），表明測序數據足夠真實反映M9T337不同部位內生固氮菌群落的多樣性；M9T337根、枝、葉的內生固氮菌Shannon指數（2.53、1.93、2.47）和Simpson（0.57、0.49、0.59）指數無顯著差異（P＝0.58，P＝0.94）；Chao1指 數（555.519、242.005、365.417）和Observed species指數（457.875、201.175、289.15）差異顯著（P＝0.05，P＝0.05），總體表現為根＞葉＞枝。Pielou指數顯示，根、葉、枝內生固氮菌均勻度（0.286、0.302、0.252）無顯著差異（P＝0.87）。

圖2 M9T337不同部位內生固氮菌的Alpha多樣性指數

2.3 M9T337不同部位內生固氮菌Beta多樣性分析

Beta多樣性是指沿著環境梯度變化的不同群落之間，物種組成的相似性、差異性以及物種沿環境梯度的更替速率，因此也被稱為生境間多樣性（between-habitat diversity）。通過主坐標分析（principal coordinate analysis，PCoA）可展示樣本組間是否具有差異。由圖3可知，主坐標1（Axis 1）和主坐標2（Axis 2）的樣本差異貢獻率分別為54.9%和7.3%。其中主坐標1是差異的主要來源，通過主坐標1可以對根部和枝部內生固氮菌群落聚類，表明根部和枝部組間群落結構差異較大。葉部有2個樣本點落在根部聚類，2個樣本點落在枝部聚類，說明葉部內生固氮菌群落結構與根和枝均有一定相似性。

圖3 M9T337不同部位內生固氮菌的PCoA分析

2.4 M9T337不同部位內生固氮菌種群歸類分析

以97%相似水平對樣本序列進行OTU聚類分析，M9T337不同部位的內生固氮菌分類階層總數明顯不同（表1）。其中，根部內生固氮菌可歸類到4個門（phylum），6個綱（class），11個目（order），17個科（family），22個屬（genus）；枝部內生固氮菌可歸類到4個門，6個綱，10個目，16個科，17個屬；葉部內生固氮菌可歸類到5個門，7個綱，12個目，19個科，26個屬。葉部的內生固氮菌種類高于根部和枝部。

表1 M9T337不同部位內生固氮菌群落分類階層總數

韋恩圖能直觀展示樣本中共有和獨有OTU數目，可反映出樣本間OTU數目組成的相似性及重疊情況。由圖4可知，不同部位內生固氮菌群體組成存在較大差異，3個部位共有OTU數為155個（14.78%）。根部特有的OTU數最多，為298個（28.41%），葉部特有OTU為95個（9.06%），枝部特有OTU為60個（5.72%）。葉部和根部共有的OTU數最多，為478個（45.57%），葉部和枝部共有OTU為256個（24.41%），根部和枝部共有OTU為172個（16.40%）。

圖4 M9T337不同部位內生固氮菌總樣本OTU的韋恩圖

2.5 M9T337不同部位內生固氮菌群落組成

2.5.1 門水平下的群落組成 根部內生固氮菌群分布在4個門，包括變形菌門（Proteobacteria，85.15%）、放線菌門（Actinobacteria，0.36%）、藍藻菌門（Cyanobacteria，0.03%、）和厚壁菌門（Firmicutes，0.0005%）（圖5）。枝部內生固氮菌群分布在4個門，包括變形菌門（87.09%）、放線菌門（0.29%）、藍藻菌門（0.01%）和厚壁菌門（0.007%）。葉部內生固氮菌群分布在5個門，包括變形菌門（83.07%）、放線菌門（1.78%）、藍藻菌門（0.12%）、厚壁菌門（0.02%）和廣古菌門（Euryarchaeota，0.003%）。

圖5 M9T337內生固氮菌在門水平下的物種組成

3個部位共有的且相對豐度最高的均為變形菌門，其次是放線菌門。其中廣古菌門是葉部樣本所特有。此外，M9T337根、枝、葉部內生固氮菌存在未鑒定及不可歸類的門，其相對豐度在12.59%～15.01%。

2.5.2 屬水平下的群落組成 從屬水平看（圖6），M9T337根部豐度前20的內生固氮菌群包括固氮螺菌屬（Azospirillum，31.19%）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium，16.78%）、斯克爾曼氏菌屬（Skermanella，0.39%）、弗蘭克氏菌屬（Frankia，0.36%）、固氮根瘤菌屬（Azorhizobium，0.28%）、拜葉林克氏菌屬（Beijerinckia，0.1%）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium，0.08%）、中生根瘤菌屬（Mesorhizobium，0.05%）、腸 桿 菌 屬（Enterobacter，0.05%）、固氮菌屬（Azotobacter，0.04%）、Methyloferula（0.03%）、假食酸菌屬（Pseudacidovorax，0.03%）、甲基彎曲菌屬（Methylosinus，0.006%）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas，0.002%）、芽孢桿菌屬（Bacillus，0.0006%）、假 單 胞 菌 屬（Pseudomonas，0.0006%）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio，0.0002%）、地桿 菌 屬（Geobacter，0.0002%）、Paraburkholderia（0.0001%）、Azonexus（0.0002%）。

圖6 M9T337內生固氮菌在屬水平下的物種組成

葉部豐度前20的內生固氮菌群包括慢生根瘤菌屬（11.92%）、固氮螺菌屬（1.88%）、弗蘭克氏菌屬（1.78%）、固氮根瘤菌屬（1.29%）、腸桿菌屬（0.38%）、斯克爾曼氏菌屬（0.09%）、Methyloferula（0.07%）、Paraburkholderia（0.04%）、中生根瘤菌屬（0.02%）、脫硫弧菌屬（0.02%）、芽孢桿菌屬（0.01%）、拜葉林克氏菌屬（0.01%）、地桿菌屬（0.01%）、Pleomorphomonas（0.01%）、黃色桿菌屬（Xanthobacter，0.009%）、甲基彎曲菌屬（0.008%）、甲烷絲菌屬（Methanothrix，0.003%）、嗜糖假單胞菌屬（0.002%）、類 芽 胞 桿 菌 屬（Paenibacillus，0.001%）、固氮菌屬（0.0007%）。

枝部可歸類到屬的內生固氮菌群僅有17種，包括慢生根瘤菌屬（8.64%）、固氮根瘤菌屬（1.79%）、固氮螺菌屬（0.45%）、腸桿菌 屬（0.31%）、弗蘭克氏菌屬（0.29%）、固氮弓菌屬（Azoarcus，0.07%）、地桿菌屬（0.06%）、脫硫弧菌屬（0.05%）、甲基彎曲菌屬（0.04%）、產氫細菌屬（Ethanoligenens，0.007%）、黃 色 桿 菌 屬（0.004%）、Methyloferula（0.002%）、Paraburkholderia（0.002%）、伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia，0.0008）、斯克爾曼氏菌屬（0.0007%）、中生根瘤菌屬（0.0005%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella，0.0002%）。

葉部和枝部的最優菌屬是慢生根瘤菌屬，根部的最優菌屬是固氮螺菌屬。甲烷絲菌屬、類芽胞桿菌屬、脫氯單胞菌屬（Dechloromonas，0.0003%）、Azospira（0.0001%）是葉部特有屬；產氫細菌屬（0.007%）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella，0.0002%）是枝部特有屬；Azonexus（0.0002%）、假單胞菌屬（0.0006%）是根部特有屬。此外，M9T337根、枝、葉部內生固氮菌存在大量未鑒定及不可歸類的屬，其相對豐度在50.61%～88.29%，這表明M9T337不同部位內生固氮菌存在大量新屬種的可能。

2.6 M9T337不同部位樣本間的相似性分析

為進一步比較樣本間的物種組成差異，實現對各樣本物種豐度分布趨勢的展示，基于屬水平的物種注釋及豐度分析，選取M9T337中平均豐度前28位的內生固氮菌屬繪制聚類熱圖。

結果（圖7）顯示，枝部和葉部樣本聚類在一起，說明屬水平枝與葉部內生固氮菌群落組成較相似。層級聚類可以展示不同菌屬的相關性，不同類群菌屬被拆分成3簇，固氮菌屬、中華根瘤菌屬、假食酸菌屬、斯克爾曼氏菌屬等聚在第1簇，在根部的豐度明顯高于枝和葉部；固氮弓菌屬、產氫細菌屬、克雷伯氏菌屬、脫硫弧菌屬、地桿菌屬等聚在第2簇，在枝部豐度明顯高于根和葉部；腸桿菌屬、黃色桿菌屬、Methyloferula、Paraburkholderia以及弗蘭克氏菌屬聚在第3簇，在葉部豐度明顯高于根和枝部。不同類群菌屬組間豐度差異較大，均有各自區別于其他兩個部位的高豐度菌屬。

圖7 M9T337內生固氮菌在屬水平的物種組成聚類熱圖

3 討論

本試驗首次利用高通量測序技術對蘋果植株內生固氮菌進行研究，結果表明內生固氮菌廣泛分布在蘋果砧木M9T337根、枝、葉各個組織。早在1958年，Dabereiner和Ruschei等首次從熱帶甘蔗的根際分離到固氮細菌。后期相繼在水稻［17］、棕櫚樹［18］、玉米［19］、小麥［20］等植物中利用可培養技術分離獲得內生固氮菌。隨高通量測序技術的發展，前人利用基于NifH基因的高通量測序技術研究了玉米、巨菌草等植物內生固氮菌的多樣性及群落結構［21，22］。現已在一系列草本、木本植物中驗證了內生固氮菌的存在，暗示著內生固氮菌可能與內生菌一樣普遍存在。

在Alpha多樣性分析中，M9T337內生固氮菌群在根、枝、葉部位分布均勻，多樣性差異不顯著，Shannon指數范圍在1.93～2.53，根部和葉部多樣性總體一致并略高于枝部。內生固氮菌定殖于植物體內，在不同部位、不同地區、不同樹種中均表現出豐富的群落多樣性。賈雨雷等［11］研究發現禾本科作物巨菌草根的內生固氮菌群落多樣性在不同地區有較大差異，Shannon指數范圍在1.52～3.76；羅娜等［23］發現茄科植物辣椒根、莖、葉內生固氮菌多樣性豐富，不同部位Shannon指數范圍在0.53～1.07；牛艷芳［24］對內蒙古根河地區不同林木樹種根際土壤固氮菌多樣性進行研究，發現3個樹種（興安落葉松、白樺、山楊）的根際土壤固氮菌Shannon指數范圍在0.92～1.87。

內生固氮菌分布具有很大的異質性，本研究中內生固氮菌豐富度在M9T337不同部位表現出顯著差異，且根＞葉＞枝。林標聲等［22］應用高通量測序技術發現巨菌草在同一生長時期內生固氮菌根部中的微生物菌群豐富度明顯多于莖和葉，且根＞葉＞莖。李劍峰等［25］研究發現沙蓬內生固氮菌分布在宿主不同生長時期和不同組織部位，且主要分布于根系和葉片，根部的豐富度較高。不同植物不同部位的內生固氮菌總體表現為根部多樣性與豐富度占優勢。

M9T337根、枝、葉內生固氮菌組成及豐度存在差異，不同部位既有共有物種，又有獨有物種。在門水平上，植株3個部位最優內生固氮菌門均為變形菌門，其次為放線菌門。已有研究表明變形菌門是多數植物內生菌的最優菌門［26］，巨菌草［22］中優勢內生固氮菌門為變形菌門和藍藻菌門；玉米［27］中優勢內生固氮菌門為變形菌門和擬桿菌門（Bacteroides）。在門水平上植物內生固氮菌的組成具有相似性。

在屬水平上，慢生根瘤菌屬是葉部和枝部的優勢菌屬，固氮螺菌屬是根部的優勢菌屬。慢生根瘤菌屬是一種普遍存在于植物內部具有固氮作用的根瘤菌，最早從豆科植物根部分離出來，屬好氧或兼性厭氧菌［28］。固氮螺菌屬是兼性內生固氮菌，為典型的植物根際聯合固氮菌，許多固氮螺菌能將亞硝酸鹽還原為N2O和N2，能利用多種碳源和氮源進行代謝［29］。除了幾種主要的內生固氮菌外，總豐度較高的還有放線菌門的弗蘭克氏菌屬，此菌屬最顯著的特征是能與非豆科木本植物共生固氮［30］。此外，在根部豐度較高的斯克爾曼氏菌屬以及固氮螺菌屬都是變形菌門紅螺菌目下的菌屬，紅螺菌目是由光合細菌組成的一個目，所有的種都營厭氧光合作用，不釋放氧氣［31］。每個部位除了共有的菌屬，還有獨有的菌屬。根部中特有的假單胞菌屬具有分泌有機酸（如甲酸、醋酸、丙酸）的能力，這些酸可將土壤中不溶性磷素轉變為可溶性磷素，同時一些羥酸可與鈣、鐵等形成螯合物，使磷能夠有效溶解及被植物吸收［32］，是植物根際常見的聯合固氮菌。葉部特有的Azospira以及根部特有的Azonexus也是變形菌門紅螺菌目下的菌屬，表明紅螺菌目下的菌屬作為內生固氮菌屬普遍存在于M9T337植株不同組織部位。枝部特有的腸桿菌科的克雷伯氏菌屬兼性厭氧菌，營養要求不高，有呼吸和發酵兩種類型的代謝，部分菌株具有固氮能力，此外枝部特有的產氫細菌屬具有高效產氫能力［33］，參與植物體代謝活動。結合物種組成熱圖中的層級聚類分析，可以發現不同部位的菌屬聚類有其規律，根中豐度較高的固氮菌屬、中華根瘤菌屬、假食酸菌屬、斯克爾曼氏菌屬等聚在第一簇，主要是一些典型的根際聯合固氮菌［34－36］；枝部豐度較高的固氮弓菌屬、產氫細菌屬、克雷伯氏菌屬、脫硫弧菌屬以及地桿菌屬等聚在第2簇，主要是與厭氧呼吸及代謝活動有關的菌屬［33，37］；葉部中豐度較高的腸桿菌屬、黃色桿菌屬、Methyloferula以及弗蘭克氏菌屬等聚在第3簇，主要是與固氮、光合作用以及呼吸活動有關的菌屬［38－40］。此外3個部位內生固氮菌還存在大量未定屬的OTU序列，表明植株不同部位含有大量發揮固氮活性的內生固氮菌未找到與目前采用的數據庫相匹配的分類信息，存在大量新屬種的可能。

本研究首次在蘋果葉部發現了特有的內生固氮古菌，歸屬于廣古菌門甲烷微菌綱（Methanomicrobia）甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）甲烷絲菌屬。早期的研究認為古菌主要存在于一些極端環境中，Xu等［41］應用可培養技術從我國西藏鹽堿湖底泥中分離到兩種嗜鹽堿古菌新種，隨后又有多名學者從不同的生境中分離得到了古菌，說明古菌普遍存在于土壤、淤泥等外界環境中。但利用非培養方法研究植物內生古菌的報道并不多，早期有學者構建了玉米內生古菌的克隆文庫，但在克隆文庫中檢測到的古菌豐富度很低［42］；孫磊［43］通過非培養方法發現水稻內生菌群落中存在古菌。本研究首次在蘋果葉部發現內生固氮古菌的存在，后續可進一步擴大樣品量明確其他部位是否存在內生固氮古菌。

在相似性分析中，葉部和枝部聚類在一起，表明這兩個部位的內生固氮菌群相似性較高，結合Beta多樣性分析，發現葉部內生固氮菌群與根、枝部都有交叉。推測由于土壤中的固氮微生物進入植株根部，部分從植株根部向枝部、莖部遷移，葉部、枝部便與根部產生共有物種。

4 結論

內生固氮菌在蘋果砧木M9T337不同組織部位中普遍存在；植株根、枝、葉部內生固氮菌多樣性無顯著差別，但豐富度差異顯著，根部豐富度最高，枝部豐富度最低；M9T337不同組織部位內生固氮菌的最優菌門均為變形菌門，葉部和枝部的最優菌屬是慢生根瘤菌屬，根部的最優菌屬是固氮螺菌屬；M9T337葉部存在內生固氮古菌。