腎上腺嗜鉻細胞瘤一家系中的MAX基因p.R66X突變

韋學成 雷思羽 何屹*

作者單位： 314000 浙江中醫(yī)藥大學嘉興學院聯(lián)培基地（韋學成）314000 浙江省嘉興市第一醫(yī)院（雷思羽 何屹）

嗜鉻細胞瘤（pheochromocytoma，PHEO）是起源于腎上腺髓質嗜鉻細胞的腫瘤，通過分泌、合成大量兒茶酚胺而引起以高血壓、高代謝、高血糖等一系列臨床癥狀。其中遺傳性PHEO 為常染色體顯性遺傳疾病，具有高度外顯性。在臨床上盡早了解患者在PHEO 方面的潛在風險因素，對此種疾病的診治及預后有著至關重要的意義。本研究筆者回顧性分析1 個PHEO 家系患者的臨床診治資料，對患者及其家系進行相關突變基因檢測，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2005 年12 月至2021 年5 月在嘉興市第一醫(yī)院泌尿外科收治及臨床隨訪的1 個漢族PHEO 家系（見圖1），進行了詳細的家系調查、相關輔助檢查及相關突變基因檢測。患者（II1），男，首診年齡24 歲。（1）2005 年12 月因“血壓升高2 年余，體檢發(fā)現(xiàn)右腎上腺腫瘤2 周”于本院診治，B 超、CT 檢查示“右側腎上腺占位”，排除禁忌后行“腹腔鏡下右腎上腺腫瘤切除術”。病理診斷：嗜鉻細胞瘤。（2）2016 年11 月因體檢發(fā)現(xiàn)“右側甲狀腺結節(jié)”于本院診治。B 超顯示右側甲狀腺中上極偏外側1.0 cm×0.7 cm×0.4cm 低回聲區(qū)，邊界欠清，形態(tài)欠規(guī)則。全麻下行右側甲狀腺全切+右頸部淋巴結清掃術。病理診斷：亞急性甲狀腺炎。（3）2017 年8 月因體檢發(fā)現(xiàn)“左側腎上腺占位”入住本院。入院血壓值為123/84 mmHg，去甲腎上腺素2,766.00 ng/L（正常值：0～600 ng/L），腎上腺素、血清鉀、ACTH 促腎上腺皮質激素（4PM、8PM）、醛固酮（立臥位）、高血壓三項（立臥位）、血皮質醇（4PM、8AM）等均在正常范圍內。腫瘤相關物質未見明顯異常。計算機斷層掃描（computer tomography，CT）檢查示左腎上腺3.8 cm×2.9 cm 占位。甲狀腺B 超提示甲狀腺右葉切除術后，左葉未見明顯腫大及占位。其余入院常規(guī)檢驗檢查未見明顯異常。經α 受體阻滯劑鹽酸酚芐明降壓和擴容治療后，行腹腔鏡下左側腎上腺PHEO 切除術。術中血壓保持平穩(wěn)，離斷腫瘤瘤體時沒有發(fā)生難以調控的低血壓。病理診斷：嗜鉻細胞瘤（圖2B），免疫組化：CGA（+），Syn（+），Inhibin（+，皮質），Calretinin（+，皮質），S-100（+），Ki67（+，1%），CK（-），Vinmentin（+），PAX-8（-），EMA（-），CD31（+，血管）。術后血壓116/70 mmHg。2017 年9 月對其家族成員進行MAX 基因檢測，發(fā)現(xiàn)無癥狀1 例MAX 基因突變攜帶者：患者兒子（III1），當時10 歲。當時測血壓正常，去甲腎上腺素、腎上腺素、血清鉀、血皮質醇（4PM、8AM）、促腎上腺皮質激素（4PM、8PM）、醛固酮（立臥位）等均在正常范圍內。腫瘤相關物質未見明顯異常。CT 檢查示雙側腎上腺未見明顯異常。甲狀腺B 超提示雙側甲狀腺未見明顯腫大及占位。建議積極隨訪觀察，以便及時處理。

1.2 MAX 基因檢測方法 本研究經本院醫(yī)院倫理委員會批準，參與者知情同意。抽取該家族所有5 位家族成員（患者包括在內）的外周血5 mL，DNA 的提取、MAX 基因的PCR 擴增、鑒定、純化和直接測序，引物序列及實驗步驟參照文獻［1-2］。解讀數(shù)據(jù)的規(guī)則依據(jù)美國醫(yī)學遺傳學和基因組學學院（american college of medical genetics and genomics，ACMG）相關指南。變異命名參照HGVS 建議的規(guī)則給出（http：//www.hgvs.org/mutnomen/）。基因檢測列表。

1.3 其他檢查 影像學檢查和臨床生化指標檢測。影像學檢查包括腎上腺和甲狀腺B 超/CT 檢查等。臨床生化指標檢測血兒茶酚胺、去甲腎上腺素、腎上腺素、血清鉀、促腎上腺皮質激素（4PM、8PM）、醛固酮（立臥位）、高血壓三項（立臥位）、血皮質醇（4PM、8AM）等。

2 結果

2.1 家系調查及臨床特點 患者父親（I1），母親（I2），患者（II1）、配偶（II2）及兒子（III1）分別64 歲、63 歲、39 歲、38 歲和13 歲，均無PHEO 的臨床、生化和相關影像學檢查的異常表現(xiàn)。患者（II1），39 歲，現(xiàn)在隨訪中。患者二次術后血壓、腎上腺CT、甲狀腺B 超、兒茶酚胺等未見明顯異常。患者兒子（III1），現(xiàn)13 歲，現(xiàn)在隨訪中。血壓、B 超、CT、兒茶酚胺等均未見明顯異常。

2.2 基因檢測結果 5 位家系成員中有2 例（II1、III1）存在MAX 基因（NM_145112）第3 外顯子（Exon 3）第196 位點c.196C＞T，p. R66 雜合無義突變，與臨床相符，為常染色體顯性遺傳，該突變會導致編碼蛋白序列提前終止，產生截短蛋白或被降解。在1000 Genomes 數(shù)據(jù)庫中未見頻率報道。其余3 名家系成員既無MAX 基因突變，也無PHEO 的臨床、生化和相關影像學檢查的異常表現(xiàn)。

3 討論

PHEO 起源于腎上腺髓質嗜鉻細胞，而起源于腎上腺外的交感神經和副交感神經的副神經節(jié)上的嗜鉻細胞的腫瘤被稱為副神經節(jié)瘤（paraganglioma，PGL）。腎上腺PHEO 約占90%，PGL 約占10%。PHEO 臨床上多散發(fā)，也可表現(xiàn)為遺傳相關。隨著基因組學研究的逐步開展，越來越多遺傳易感基因隨之發(fā)現(xiàn)，目前發(fā)現(xiàn)遺傳性PHEO 約占全部PHEO 的30%［3-4］。其中，家族性PHEO是遺傳性PHEO中一種常染色體顯性遺傳的特殊類型，約占6%～10%［5］。

目前PHEO 病因尚不明確，可能與種系基因突變密切有關，且存在遺傳傾向，隨著對于PHEO 發(fā)病中的遺傳機制研究有了一個更加深入的認知，已發(fā)現(xiàn)多種導致PHEO 發(fā)生的致病基因突變，分別為RET、VHL、NF1、SDHA、SDHB、SDHC、SDHD、SDHAF2、KIF1B、HIF2A、TMEM127、PHD1/2、FH、MAX 和MDH2 等［6-7］。自2002 年至今，全球數(shù)個研究組陸續(xù)對散發(fā)的嗜鉻細胞瘤患者進行遺傳致病基因的突變篩查，通過分析得到SDHB、SDHD、VHL 和RET 4 個基因攜帶突變率最高。而RET、VHL、NF1、SDHD、SDHAF2 則表現(xiàn)出高度的家族遺傳相關性。VHL、SDH、HIF2A 的基因突變主要與低氧反應相關，而RET、NF1、TMEM127 和MAX 主要涉及激酶信號通路，與RAS、PI3K-AKT 和mTOR 等常見下游信號分子相關［8］。

MAX 突變是新近研究發(fā)現(xiàn)的一個可能與PHEO 易感的相關因素，在PHEO/PGL 中約占1.12%［9］。MAX基因包含5 個外顯子，位于染色體14q23·3，MAX 編碼的產物是一種堿性螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loophelix zipper，bHLH）結構域的亮氨酸拉鏈蛋白，是MYCMAX-MAD 網絡中的重要組成部分。MYC-MAX-MAD網絡由一系列轉錄因子構成，它們之間的互相作用導致基因特異度的轉錄激活或抑制，在細胞增殖、分化和死亡中起著重要作用［10］。MAX 通常與原癌基因MYC形成二聚體，與特定E-box 基因序列結合，激活啟動子，編碼相關蛋白，促進細胞增殖、血管生成等。大鼠PHEO 細胞系PC12 在mRNA 和蛋白水平上均不表達MAX［11-12］，以此為研究對象，對PC12 引入MAX 基因后，細胞生長受到抑制，說明MAX 基因具有抑癌作用［13］，而MAX 的突變失活可能成為腫瘤發(fā)生的關鍵因素。在對多種神經源性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，截斷的MAX 蛋白與MYC 信號的轉錄抑制受損有關［14］，換句話說，MAX 截斷突變可能一定程度上增加了MYC 原癌基因的轉錄，因此發(fā)生致癌作用。PHEO 的發(fā)生發(fā)展與RAS-PI3K-AKT-mTOR 軸密切相關，RET［14］、NF1［15］、TMEM127［16］等基因突變發(fā)揮的致癌作用也與此相關。由于RAS-PI3K-AKT-mTOR 和MYC-MAX-MAD 網絡之間存在交叉相關，因此，MYC 網絡中央調節(jié)蛋白MAX 的改變也會導致PHEO 也就不足為奇，PHEO 中的MAX突變避免了MAX 對E-box 目標基因序列的轉錄抑制，從而引起了致瘤性MYC 的解除，從而引起了PHEO的發(fā)生。目前研究已發(fā)現(xiàn)20 余種MAX 基因突變，通常可分為截斷突變（c.97C＞T、c.223C＞T 等）、錯義突變（c.73C＞T、c.269G＞C 等）及未定義突變（c.18C＞T、c.414G＞A 等）［9］。本研究筆者發(fā)現(xiàn)c.196C＞T 截斷突變位于第3 外顯子，為國內首次報道。

此外，有研究表明，MAX 基因突變與惡性程度有關［9］。但是由于惡性標記知識有限，通常臨床上只有發(fā)現(xiàn)腫瘤轉移后才能診斷發(fā)現(xiàn)，因此往往缺乏有效且及時的治療，成為PHEO 診斷和治療的極大挑戰(zhàn)。早前研究已發(fā)現(xiàn)SDHB 基因突變者具有高度惡性傾向［8］，而SDH 的其他亞型則沒有，其中機制未明。此外，研究發(fā)現(xiàn)，MAX 基因突變可能也是引起PHEO 惡性程度增加的一個原因。MAX 突變與腫瘤轉移行為有關，大約10%的MAX 突變病例出現(xiàn)轉移［9］。但MAX 突變引起PHEO 惡性程度增加目前只是一個初步判斷，參與PHEO/PGL 惡性轉化的機制尚未闡明，還需進一步研究加以證實。

本研究通過對一腎上腺PHEO 家系的全基因組學分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的致病性或可能致病的MAX 外顯子基因變異。該家系中有2 例（患者II1 及其兒子III1）存在MAX 基因c.196C＞T，p.R66X 截斷突變，且明顯存在家族遺傳傾向，并符合先前研究的父系遺傳的特點，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的又一個MAX 基因的新位點的突變。盡管本研究入選病例數(shù)較少，但不可否認，MAX 基因c.196C＞T 突變與PHEO 的發(fā)生發(fā)展存在密切關聯(lián)。盡管該病例中患者未被發(fā)現(xiàn)有明確的PHEO 惡性轉移征象，但由患者雙側、多發(fā)等一系列癥狀表明，該MAX 基因突變很大程度上可能存在不良生物學行為，上述變異可能存在致惡性PHEO 作用，因此，MAX 突變的早期發(fā)現(xiàn)對PHEO 患者及其家系的重要性不言而喻。通過基因檢測可至少對30%的PHEO 種系基因突變的患者進行正確診斷，然后進行早期監(jiān)測，從而更加及時和有效地進行治療。因此，對p.R66X 突變者，10 歲起應每年檢測血或尿3-甲氧基腎上腺素、3-甲氧基去甲腎上腺素及腎上腺影像學檢查，監(jiān)測可能發(fā)生的PHEO，有利于患者早期診治。

綜上所述，筆者研究發(fā)現(xiàn)一個MAX 基因的c.196C＞T，p.R66X 截斷突變，為今后家族性PHEO 的識別提供相應指導，而且結果表明在高危患者及其家屬中對MAX 及相關基因進行分子篩查并且早期干預是十分重要的，特別是雙側、多發(fā)PHEO/PGL 和混合去甲腎上腺素、腎上腺素表型的患者，早期的診治可以有效預防各種心血管并發(fā)癥。筆者期待通過外顯子基因測序技術的不斷發(fā)展和基因檢測工作的逐步開展，對PHEO患者的診斷治療和綜合管理能夠得到顯著的改善。