康柏西普對DME患者黃斑部微循環的影響

符樹宇，黃雄高，胡衛文，唐吉森，陳又珍，劉 亮

0引言

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病性微血管病變中最嚴重的并發癥之一，而DR患者視力障礙最主要的原因則是糖尿病性黃斑水腫(DME)[1]，血管內皮生長因子(VEGF)已被證實在DME的發病過程中起著重要作用，玻璃體腔內注射抗VEGF藥物治療DME已廣泛應用于臨床。有報道顯示玻璃體腔內注射抗VEGF藥物會引起視網膜動脈或靜脈收縮、黃斑中心凹無血管區擴大等情況[2]，提示抗VEGF藥物可能會導致視網膜缺血加重。目前對于抗VEGF藥物是否會引起視網膜缺血加重仍未有統一的觀點，相關研究發現使用抗VEGF藥物后視網膜微循環變化與房水因子的改變相關[3]。血管生成素樣蛋白4(ANGPTL4)作為缺血性視網膜病變的相關生物標記物，可從細胞因子層面來預測抗VEGF藥物治療DME對視網膜微循環的影響[4]。本研究旨在探討康柏西普治療DME對視網膜微循環的影響。

1對象和方法

1.1對象前瞻性對照研究。收集2019-12/2020-12就診于海南醫學院第一附屬醫院眼科并診斷為DME的患者14例15眼，其中符合篩選條件的10例11眼納入本研究為DME組，其中男2例，女8例，年齡中位數為56(42～73)歲，右眼7眼，左眼4眼，治療期間所有DME患者糖化血紅蛋白均控制在10%以內[治療前,治療后3、5mo平均糖化血紅蛋白分別為(8.23±0.966)%、(8.04±0.769)%、(7.91±0.511)%]。選取無全身系統疾病和眼底疾病的年齡相關性白內障患者15例15眼作為白內障組，其中男5例，女10例，年齡中位數為56(53～62)歲，右眼5眼，左眼10眼。選取年齡性別相匹配的正常視力健康人20例20眼作為對照組，其中年齡中位數為47(42～49)歲，其中男8例，女12例。DME組與白內障組年齡比較，差異無統計學意義(P=0.667)；DME組與對照組年齡比較，差異具有統計學意義(P=0.004)。糖尿病患者發生DME年齡都偏大，而年齡較大的健康人群，因其伴有年齡相關性白內障或其他眼部疾病以及全身系統疾病，其最佳矯正視力(BCVA)很難達到1.0，因此我們隨機選取了年齡相對匹配且視力正常的健康人群作為對照組，本研究主要觀測DME患者注射康柏西普后眼部各項指標變化，對照組一般資料的差異并不影響研究結果。DME組納入標準：(1)18歲以上的2型糖尿病患者；(2)經熒光素眼底血管造影確診為非增殖性糖尿病視網膜病變(NPDR)；(3)OCT檢測黃斑中心凹視網膜厚度(CMT)≥250μm。排除標準：(1)除DME外引起視力下降的其他視網膜疾病；(2)前6mo內的視網膜治療或內眼外科手術史；(3)眼壓≥25mmHg；(4)屈光不正，近視>6.00D或遠視>3.00D；(5)嚴重的屈光介質不清和其他需要住院的系統性疾病；(6)未完成6次注射而中途終止的患者。白內障組患者納入標準：(1)確診為年齡相關性白內障患者，且需行手術治療；(2)無任何其他眼部疾病；(3)無高血壓、糖尿病等全身慢性疾病；(4)無手術史。需收集房水的患者均于術前告知患者，并簽署相關知情同意書后，再于術中收集房水樣本。本研究通過海南醫學院第一附屬醫院倫理委員會審批。

1.2方法

1.2.1一般檢測項目對照組、DME組術前和術后隨訪均由我院同一名具有經驗的眼科技師行眼科Snellen表視力、非接觸式眼壓、綜合驗光、眼底照相檢查。

1.2.2OCT及OCTA檢查應用Cirrus HD OCT 5000光學相干斷層掃描儀選擇520線×128線黃斑掃描模式，對黃斑中心凹進行掃描，選取B掃描成像清晰的圖片，由軟件自動計算出CMT;選取黃斑區的6mm×6mm毛細血管掃描模式，獲取黃斑區6mm×6mm范圍的毛細血管圖像。選取內界膜至視網膜內叢狀層外界作為視網膜淺層進行測量，視網膜淺層毛細血管中心凹無血管灌注區(FAZ)面積由同一名眼科醫師應用Cirrus HD 5000 V.10.0 Angio Plex Metrix軟件測量，人工描繪出FAZ邊界，再由軟件自動計算出FAZ面積。視網膜淺層毛細血管長度密度(VSCP)和視網膜淺層毛細血管灌注密度(PSCP)均由同一款軟件自動測量，測量范圍為以黃斑中心為中點、6mm×6mm的方形區域。VSCP為通過描繪血管的線性長度，計算區域內線性長度與區域面積的比值;PSCP為通過描繪血管直徑寬度，計算血管管徑在區域內的覆蓋面積與區域面積的比值。

1.2.3房水因子檢測檢測細胞因子的方法：術中房水收集在無菌管后立即存放在-80℃的實驗用冰箱中，采用Luminex檢測技術進行檢測，檢測試劑盒為LXSAHM-09,經過樣品稀釋、混勻、吸附和孵育等步驟，所有步驟均嚴格按照說明書進行操作，樣品與標準品送微球懸浮陣列技術(Luminex200TM)檢測儀檢測，自動計算獲得樣品濃度。

1.2.4手術方法DME組均行每月1次玻璃體腔注射康柏西普眼用注射液共計6次，術前使用鹽酸左氧氟沙星滴眼液1d，并于當日手術前沖洗結膜囊。手術中用鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉患眼并嚴格按照內眼手術規范進行消毒鋪巾。在注射康柏西普前,使用1mL注射器針頭于顳側角膜緣穿刺入前房,抽取房水約0.1mL,撤針后角膜穿刺口自閉。隨后用1mL注射器抽取0.05mL康柏西普于顳上方角膜緣后3.5～4.0mm向玻璃體腔內垂直進針注藥，完成注射后迅速拔出針頭,用鑷子夾閉穿刺點防止返流。術后使用抗生素眼膏涂于結膜囊內，并連續3d使用左氧氟沙星滴眼液點眼，每天4次。治療后1mo再次注射,共連續注射6次。白內障組患者均于術中行透明角膜切口前使用1mL注射器針頭抽取房水約0.1mL。所有操作均由同一位經驗豐富的眼科醫師完成。

2結果

2.1術前DME組與對照組PSCP、VSCP、FAZ面積的對比DME組術前PSCP、VSCP較對照組小，FAZ面積較對照組大，差異均有統計學意義(P<0.01,表1,圖1)。

圖1 DME患者注射康柏西普后黃斑區視網膜OCTA、OCT圖像 A：術前；B：注射1mo時；C：注射2mo時；D：注射3mo時；E：注射4mo時；F：注射5mo時。

表1 DME組與對照組術前BCVA、CMT、VSCP、PSCP、FAZ面積對比

2.2術前DME組與對照組CMT及BCVA的對比術前DME組CMT、BCVA值均較對照組高，差異均有統計學意義(P<0.001，表1)。

2.3術前DME組與白內障組相關房水因子對比DME組術前房水中IL-6、IL-8、VEGF、ANGPTL4均較白內障組高，差異均有統計學意義(P<0.001，表2)。

表2 術前DME組與白內障組相關房水因子濃度對比 pg/mL

2.4康柏西普治療后DME患者PSCP和VSCP及FAZ面積的變化DME患者注射康柏西普前后不同時間PSCP比較，差異有統計學意義(F=4.562，P<0.05，表3)，注射康柏西普前后不同時間VSCP、FAZ比較差異均無統計學意義(F=0.376、0.084，均P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo時PSCP與基線，注射康柏西普1mo時與注射4、5mo時比較，差異具有統計學意義(P=0.035、0.004、0.001、0.001、0.026、0.013)，其余時間點兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3，圖2。DME組患者于注射康柏西普1mo時PSCP改善最明顯。與基線相比，注射康柏西普5mo時DME患者黃斑部微循環缺血改善。

圖2 DME患者注射康柏西普后PSCP、BCVA、CMT的變化 A：PSCP；B:BCVA；C：CMT。

表3 使用康柏西普后DME患者眼部檢查各參數變化

2.5康柏西普治療后DME患者CMT和BCVA的變化DME患者注射康柏西普前后不同時間CMT、BCVA比較，差異均有統計學意義(F=2.935、4.357，均P<0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時BCVA與基線比較均有改善(P=0.044、0.004、0.001、0.001、0.001)，其余時間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。注射康柏西普2、3、4、5mo時CMT與基線相比差異具有統計學意義(P=0.015、0.006、0.003、0.002)，其余時間點兩兩相比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表3，圖1、2。注射康柏西普1mo時BCVA提升以及CMT下降最明顯。與基線相比，注射康柏西普5mo時視力明顯提高，CMT顯著下降。

2.6康柏西普治療后DME患者房水因子的變化DME患者使用康柏西普后不同時間房水ANGPTL4、VEGF、IL-6濃度比較，差異有統計學意義(均P<0.05)，不同時間房水中IL-8濃度變化無統計學意義(P>0.05)。注射康柏西普3、4、5mo時房水中ANGPTL4的濃度與基線相比差異具有統計學意義(P=0.015、0.006、0.003)，其余時間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時房水中VEGF的濃度與基線，注射康柏西普3、4、5mo時與1mo時相比差異均具有統計學意義(P=0.001、0.001、0.001、0.001、0.001、0.047、0.023、0.015)，其余時間點兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。注射康柏西普1、2、3、4、5mo時房水中IL-6濃度與基線相比差異具有統計學意義(P=0.035、0.001、0.001、0.001、0.001)，其余時間兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。DME組患者于注射康柏西普1mo時房水中ANGPTL4、VEGF及IL-6濃度下降最明顯，見表4。與基線相比，注射康柏西普5mo時 ANGPTL4、VEGF、IL-6下降。

表4 使用康柏西普后DME患者房水因子濃度變化 pg/mL

2.7康柏西普治療后各參數變化的相關性分析DME患者每月注射康柏西普1次連續6mo后VEGF變化的絕對值與CMT變化的絕對值呈正相關(rs=0.716，P=0.013)，表明房水中VEGF濃度越降低，CMT越降低，與其余各參數的變化絕對值均無相關性(P>0.05)。

3討論

本研究結果顯示，DME組連續每月1次注射康柏西普6mo后淺層毛細血管密度逐漸增加，VSCP略有增加及FAZ面積減小的趨勢，與Zhu等[5]的研究結果相似，并且DME組患者在第1次注射康柏西普后PSCP改善最明顯，但其改善視網膜缺血的機制尚未明確。既往研究認為持續高血糖狀態會產生晚期糖基化終產物(AGEs)，AGEs可引起血管硬化、激活AGEs內皮受體而增加相關細胞因子表達，最終導致毛細血管收縮、視網膜缺血缺氧。視網膜缺血缺氧狀態下，機體代償性產生VEGF以恢復血液供應。但玻璃體腔內高濃度的VEGF會引起內皮細胞、血-視網膜屏障的破壞，并在血管內募集白細胞增加其對視網膜血管內皮細胞的黏附，導致血管堵塞和灌注減少，最終加重視網膜缺血缺氧。有研究顯示使用抗VEGF藥物可以改善DME患者視網膜血管灌注，其機制可能為抑制VEGF可以減少白細胞堵塞，使封閉血管再灌注[6-7]。此外，在一項關于抗VEGF治療腫瘤的研究中，發現抑制VEGF可以破壞缺乏外周細胞的血管，將未成熟的血管重塑為更成熟的血管，并且穩定基底膜為新生血管再次生長提供框架，該機制可能同樣作用于視網膜內[8-9]。

研究顯示ANGPTL4水平與視網膜血流供應相關，其通常表達于缺血性視網膜病中[10]。ANGPTL4與視網膜血流供應相關的原因在于其不僅促進動脈硬化，還促進血管炎癥并增加其通透性，加重視網膜缺血[11]。相關研究發現，缺血性視網膜病小鼠模型中，隨著缺氧誘導因子-1(HIF-1)在缺氧視網膜Müller神經膠質細胞中的積累，ANGPTL4表達增加，可以作為反映視網膜缺血相關的生物標志物[12]。此外，Kwon等[4]的研究發現使用抗VEGF藥物可以減少DME患者視網膜血管的丟失，并恢復無灌注區血供，通過檢測房水中ANGPTL4的濃度發現，ANGPTL4的濃度與視網膜無灌注區面積成正相關，并認為ANGPTL4可反映視網膜血液供應情況。結合本研究結果，注射康柏西普后DME患者房水中ANGPTL4濃度下降，并于注射康柏西普1mo時下降最顯著，因此本研究結果從細胞因子層面證實注射康柏西普可以改善黃斑部微循環缺血。

本研究結果顯示，注射康柏西普后，DME患者BCVA顯著提高，CMT顯著下降，并均于注射康柏西普1mo時改善最顯著，與Zhou等[13]的研究結果一致。既往研究已證實，VEGF是引起DR患者黃斑水腫的重要因子，其作用機制是高濃度的VEGF破壞血管內皮細胞及血-視網膜屏障，引起黃斑水腫[1]。康柏西普是我國自主研發的新型抗VEGF藥物，它是一種重組融合蛋白，含有VEGF受體1(VEGFR1)的第二個免疫球蛋白(Ig)結構域和VEGFR2的第三和第四Ig結構域和人IgG的Fc區，它可以與VEGF-A、VEGF-B和胎盤生長因子(PlGF)的所有同工型結合。理論上它對VEGF的親和力較單抗類藥物更強[14]。Liu等[15]關于康柏西普與雷珠單抗治療DME患者療效的研究發現，兩者對BCVA都有提升作用，但康柏西普減輕黃斑水腫的效果優于雷珠單抗。可能的原因在于：融合蛋白類的康柏西普，其在玻璃體腔內的半衰期為4.2d，較雷珠單抗的2.88d半衰期更長，并且其針對的靶點較單抗類藥物更多。

本研究結果顯示，隨著注射康柏西普時間的延長，DME患者房水中的VEGF、IL-6都顯著下降，與Xia等[16]的研究結果一致，他們發現使用康柏西普可以顯著減輕DR患者視網膜病變程度，以及顯著降低IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎癥因子水平，證明康柏西普對這些炎癥因子有抑制作用。其原因可能是DME發展過程中VEGF和炎癥因子作用途徑大量重疊，VEGF可刺激促炎基因的表達，并允許白細胞滲透到視網膜中[17]。值得注意的是注射康柏西普1mo時，DME患者房水中VEGF、IL-6濃度下降十分顯著，與Zhang等[18]的研究結果相似，其研究發現注射康柏西普1wk后患者房水中VEGF濃度開始顯著下降，反映康柏西普對VEGF有十分強的抑制作用。理論上VEGF作為一種促炎介質，抗VEGF治療可以抑制眼內炎癥因子水平。

此外，分析本研究中VEGF與CMT變化的絕對值發現，VEGF濃度與CMT呈正相關，與Mastropasqua等[6]的研究結果一致。側面證實了VEGF在DME的發展過程中至關重要的作用。

本研究選擇淺層毛細血管的變化反映黃斑區視網膜血液供應的原因：(1)HD-OCT獲取的淺層毛細血管密度清晰度最佳；(2)深層毛細血管的末端會被腫脹的視網膜遮擋而影響毛細血管密度的測算[19]。本研究運用PSCP、VSCP進行分析，來反映視網膜毛細血管變化。視網膜的血液供應與毛細血管的管徑大小、血液的流動速度以及血液的氧含量有關，而在評價血液供應方面PSCP優于VSCP。

本研究從細胞因子層面證實了使用康柏西普治療DME可以改善黃斑區缺血。同時本研究沒有發現使用康柏西普治療后加重視網膜缺血等情況,說明使用康柏西普治療從安全角度考慮是可行的。此外，使用康柏西普治療DME能有效提升BCVA及減輕黃斑水腫。但本研究也存在隨訪時間短、樣本量小，對遠期效果未能觀察等不足，在后續研究中還需進行更多關于康柏西普治療DME相關的細胞因子及其作用途徑的研究才能解釋其如何改善視網膜缺血。