達格列凈對高糖誘導人視網膜血管內皮細胞凋亡及氧化應激的影響

汪 洋，王 可，劉寶蘭

0引言

據調查研究顯示，截止2035年全球糖尿病發病率將增加55%，7次全國性糖尿病調查中，我國糖尿病發病率增長了17倍，糖尿病可引起多種并發癥，其中糖尿病視網膜病變是其主要并發癥之一，視網膜血管病變、視網膜神經退行性病變等是糖尿病視網膜病變的主要臨床表現[1-4]。達格列凈屬于鈉-葡萄糖轉運蛋白2的抑制劑，可減少機體對葡萄糖的吸收，其可用于控制2型糖尿病，但關于其對糖尿病視網膜病變的影響及其作用機制尚未闡明[5]。叉頭框轉錄因子O4(Forkhead Box Protein O4，FOXO4)在高糖誘導的視網膜內皮細胞中表達水平升高，miR-96-5p可靶向FOXO4抑制高糖誘導的大鼠視網膜血管內皮細胞凋亡，減輕細胞損傷[6]。但達格列凈是否可調控FOXO4而參與高糖誘導人視網膜血管內皮細胞(HRVECs)損傷過程尚未可知。因此，本研究采用高糖誘導HRVECs建立細胞損傷模型，探討達格列凈對高糖誘導HRVECs凋亡、氧化應激的影響及其對FOXO4的調控作用。

1材料和方法

1.1材料達格列凈(20191103)購自阿斯利康制藥有限公司；HRVECs購自美國ScienCell；DMEM培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；胰蛋白酶購自美國Gibco公司；Lipofectamine2000試劑購自美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染法細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；pcDNA購自武漢淼靈生物科技有限公司；SOD(20191002)、MDA(20191005)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；si-NC(UGUCAGUCGAUGCUAGUCGAU)、si-FOXO4(UAGUCAGUCGUAGCUAGUCGAUCG)、pcDNA(CAUGUACGUAGCUGAUC)、pcDNA-FOXO4(AUGUCGAUCGUAGCUAUC)購自上海吉瑪制藥技術有限公司；RIPA裂解液(20190905)、BCA定量檢測試劑盒(20190506)、ECL試劑(20190916)購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人FOXO4多克隆抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組HRVECs細胞培養后，在6孔板中培養，分別培養于含5.5mmol/L D-葡萄糖的培養液中，將其置于培養箱內繼續培養24h為正常糖組。HRVECs培養于含25mmol/L D-葡萄糖的培養液中，將其置于培養箱內繼續培養24h[7]為高糖組。HRVECs分別培養于含有不同濃度(1、5、10ng/L)達格列凈與25mmol/L D-葡萄糖的培養液中[8]，將其置于培養箱內繼續培養24h分別為高糖+達格列凈低劑量組、高糖+達格列凈中劑量組、高糖+達格列凈高劑量組。將si-NC、si-FOXO4分別轉染入HRVECs后加入25mmol/L D-葡萄糖的培養液培養24h，分別為高糖+si-NC組、高糖+si-FOXO4組。pcDNA、pcDNA-FOXO4分別轉染入HRVECs后加入10ng/L達格列凈與25mmol/L D-葡萄糖的培養液中，將其置于培養箱內繼續培養24h分別為高糖+達格列凈高劑量+pcDNA組、高糖+達格列凈高劑量+pcDNA-FOXO4組。

1.2.2流式細胞術檢測細胞凋亡率取各組HRVECs，采用PBS洗滌細胞后加入0.25%胰蛋白酶，將DMEM培養液加入其中后制備細胞懸液，將其放入15mL的離心管內，1 000r/min轉速離心5min后棄上清，將預冷PBS加入其中后離心棄上清，加入100μL Binding Buffer后分別將5μL Annexin V-FITC與1μL PI染液加入其中，室溫避光孵育15min后將400μL Binding Buffer加入其中，于1h內應用FACS Calibur流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.3檢測SOD和MDA的水平嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用反復凍融法裂解各組HRVECs，用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD的水平，用硫代巴比妥酸法檢測MDA的水平。

1.2.4Westernblot檢測FOXO4蛋白表達取各組HRVECs加入500μL RIPA裂解液提取細胞總蛋白，根據BCA試劑盒說明書操作檢測蛋白濃度，將5×SDS上樣緩沖液加入蛋白樣品中，將其置于沸水中煮10min蛋白變性，取50μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳反應，將分離的蛋白凝膠轉移至PVDF膜后使用5%脫脂奶粉封閉2h，分別加入一抗稀釋液(1∶1000)后置于4℃條件下孵育24h，采用TBST洗滌后加入稀釋比為1∶5000的二抗稀釋液，將其置于室溫條件下孵育1h，采用TBST洗滌后滴加ECL顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。同時采用脂質體轉染法將si-NC、si-FOXO4、pcDNA、pcDNA-FOXO4分別轉染至HRVECs后按照上述方法檢測FOXO4蛋白相對表達量。

2結果

2.1達格列凈對高糖誘導HRVECs凋亡的影響各組凋亡率比較差異有統計學意義(P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組細胞凋亡率升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+達格列凈中劑量組、高糖+達格列凈高劑量組細胞凋亡率降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 達格列凈對高糖誘導HRVECs凋亡的影響 A:正常糖組;B:高糖組;C:高糖+達格列凈低劑量組;D:高糖+達格列凈中劑量組;E:高糖+達格列凈高劑量組。

2.2達格列凈對高糖誘導HRVECs氧化應激的影響各組SOD和MDA比較差異均有統計學意義(P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組SOD的水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，MDA的水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+達格列凈中劑量組、高糖+達格列凈高劑量組SOD的水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)，MDA的水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3達格列凈對高糖誘導HRVECs中FOXO4蛋白表達水平的影響各組FOXO4蛋白表達水平比較差異有統計學意義(P<0.01)。與正常糖組比較，高糖組FOXO4蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+達格列凈中劑量組、高糖+達格列凈高劑量組FOXO4蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1，圖2。

圖2 達格列凈對高糖誘導HRVECs中FOXO4蛋白表達情況的影響。

表1 達格列凈對高糖誘導HRVECs凋亡和氧化應激的影響

2.4FOXO4過表達和抑制轉染效率的檢測與si-NC組(0.25±0.03)比較，si-FOXO4組FOXO4蛋白表達水平(0.11±0.01)降低，差異有統計學意義(t=7.668，P=0.002)；與pcDNA組(0.24±0.03)比較，pcDNA-FOXO4組FOXO4蛋白表達水平(0.69±0.07)升高，差異有統計學意義(t=10.234，P=0.001)，見圖3。

圖3 FOXO4蛋白表達情況。

2.5抑制FOXO4對高糖誘導HRVECs凋亡和氧化應激的影響與高糖+si-NC組比較，高糖+si-FOXO4組細胞凋亡率降低，SOD的水平升高，MDA的水平降低，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表2，圖4。

表2 抑制FOXO4對高糖誘導HRVECs凋亡和氧化應激的影響

圖4 抑制FOXO4對高糖誘導HRVECs凋亡和FOXO4蛋白表達的影響 A：流式細胞術檢測細胞凋亡率；B：Western blot檢測FOXO4蛋白表達量。

2.6過表達FOXO4對高糖誘導HRVECs凋亡和氧化應激的影響與高糖+達格列凈高劑量+pcDNA組比較，高糖+達格列凈高劑量+pcDNA-FOXO4組凋亡率升高，SOD的水平降低，MDA的水平升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，見表3，圖5。

表3 過表達FOXO4對高糖誘導HRVECs凋亡和氧化應激的影響

圖5 過表達FOXO4對高糖誘導HRVECs凋亡及FOXO4蛋白表達的影響 A：流式細胞術檢測細胞凋亡率；B：Western blot檢測FOXO4蛋白表達量。

3討論

體內持續高糖水平是誘導患者視網膜病變的重要原因之一，氧化應激、細胞凋亡等是促進糖尿病視網膜病變的主要誘導因素，目前糖尿病視網膜病變的發病機制尚未完全闡明，因而深入探究糖尿病視網膜病變的發病機制，以及研發有效預防及治療藥物均具有重要意義，既往研究證實，天麻素通過調節SIRT1/TLR4/NF-κBp65信號通路抑制高糖誘導的人視網膜內皮細胞凋亡[9]。山奈酚靶向雌激素相關受體α，并在高葡萄糖條件下抑制人視網膜內皮細胞的血管生成[10]。綠原酸可通過降低VEGF的表達并抑制VEGF介導的視網膜新血管生成而減輕糖尿病視網膜病變[11]。但仍有部分藥物對糖尿病視網膜病變的作用機制尚未闡明。

達格列凈是一種新型的降糖制劑，其具有降壓、降血糖等作用，并可預防及減輕糖尿病心血管并發癥的發生及發展[12]。達格列凈可明顯改善糖尿病心肌缺血大鼠心功能，并可恢復其心肌及血管功能[13]。本研究結果顯示，高糖誘導的HRVECs凋亡率升高，而達格列凈可明顯降低高糖誘導的HRVECs凋亡率，且達格列凈高劑量細胞凋亡率明顯低于達格列凈中劑量組，提示達格列凈可抑制高糖誘導的HRVECs凋亡。氧化應激是高糖誘發內皮細胞凋亡的重要原因之一，SOD屬于抗氧化酶，若MDA等過氧化酶類生成量過多可促進細胞內氧化應激反應的發生，進而通過一系列通路促進細胞凋亡[14-15]。本研究結果顯示，高糖誘導的HRVECs中SOD的水平降低，MDA的水平升高，與上述研究報道結果相似，而達格列凈可明顯提高高糖誘導的HRVECs中SOD的水平，降低MDA的水平，且達格列凈中劑量組、達格列凈高劑量組間SOD、MDA的水平比較具有明顯差異，提示達格列凈可抑制高糖誘導的HRVECs氧化應激而抑制細胞凋亡從而減輕細胞損傷。

為進一步探究達格列凈治療糖尿病視網膜病變的作用機制，本研究采用Western blot實驗檢測FOXO4的表達量，本研究結果顯示，高糖誘導的HRVECs中FOXO4蛋白水平升高，而達格列凈可明顯降低高糖誘導的HRVECs中FOXO4蛋白水平，且達格列凈高劑量組FOXO4蛋白水平明顯低于達格列凈中劑量組，提示達格列凈可能通過下調FOXO4而發揮作用。FOXO4屬于叉頭框蛋白家族成員，其可通過影響細胞生物學行為而發揮作用，研究表明FOXO4表達異常與糖尿病并發癥的發生密切相關，糖尿病視網膜病變中FOXO4的表達水平升高，抑制FOXO4表達可明顯降低高糖誘導的細胞氧化應激及抑制細胞凋亡[16]。FOXO4高表達可促進心肌梗塞后的早期炎癥反應[17]。miR-328-3p通過靶向FOXO4減輕低密度脂蛋白誘導的血管內皮細胞損傷[18]。本研究結果顯示，pcDNA組是空載體，是過表達的對照，FOXO4過表達與達格列凈高劑量聯合處理高糖誘導的HRVECs，結果顯示，細胞凋亡率升高，SOD的水平降低，而MDA的水平升高，提示FOXO4過表達可明顯逆轉達格列凈對高糖誘導HRVECs凋亡及氧化應激的作用。

綜上所述，達格列凈可通過抑制FOXO4的表達而抑制高糖誘導的HRVECs氧化應激及抑制細胞凋亡從而減輕細胞損傷，FOXO4可能作為達格列凈治療糖尿病視網膜病變的潛在靶標，但關于其具體作用機制仍需進一步探究。