血根堿對(duì)6種非靶標(biāo)生物的安全性評(píng)價(jià)

劉 偉師寶君馮俊濤姜軍俠沈瑩華段 鵬

(1.陜西省農(nóng)業(yè)檢驗(yàn)檢測(cè)中心,西安 710003;2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院,陜西 楊凌 712100;3.陜西先農(nóng)生物科技有限公司,西安 710018)

農(nóng)藥既是農(nóng)業(yè)所必須的生產(chǎn)資料,又是一類有毒物質(zhì),如何在有效控制有害生物的同時(shí),最大限度降低農(nóng)藥對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)生物的影響,一直是人們?cè)谵r(nóng)藥使用過(guò)程中面臨的難題。隨著“生態(tài)保護(hù)”“綠色發(fā)展”成為時(shí)代主題,中國(guó)對(duì)農(nóng)藥的安全性管理日趨嚴(yán)格。因此,研究農(nóng)藥對(duì)環(huán)境非靶標(biāo)生物的毒性與危害性,是新農(nóng)藥開(kāi)發(fā)中不可缺少的環(huán)節(jié)[1]。農(nóng)藥對(duì)非靶標(biāo)生物的影響主要是對(duì)環(huán)境有益生物而言[2]。植物源農(nóng)藥雖然具備來(lái)源天然的先天優(yōu)勢(shì),但并非所有的植物性化合物都具有對(duì)人、畜、非靶標(biāo)生物的安全性,如煙草、狼毒等對(duì)高等動(dòng)物具有較高的毒性,魚藤酮對(duì)魚類的毒性極高等[3-4]。血根堿是多年生草本植物博落回中提取的異喹啉類生物堿,是一種具殺蟲、殺菌活性的植物源農(nóng)藥[5]。目前,農(nóng)藥領(lǐng)域?qū)ρ鶋A的研究多集中在生物活性、作用機(jī)理、哺乳動(dòng)物毒性等方面[6-7],其對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性鮮見(jiàn)報(bào)道。為評(píng)價(jià)血根堿對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性,本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-13],測(cè)定血根堿對(duì)蜂、鳥、蠶、魚、溞、藻的毒性,以期為血根堿相關(guān)農(nóng)藥產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和安全合理使用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試生物與藥劑

日本鵪鶉(Coturnixjaponica):咸陽(yáng)孵化廠提供,20 日齡;家蠶(Bombyx mori):秋豐×白玉,西北農(nóng)林科技大學(xué)蠶桑研究所提供,3 齡幼蟲;蜜蜂:意大利工蜂(Apismellifera),楊凌示范區(qū)大寨鄉(xiāng)養(yǎng)蜂專業(yè)戶提供,成蜂;斑馬魚(Brachydoniorerio):體長(zhǎng)為1.7～2.5 cm,體質(zhì)量0.2～0.3 g,承載量<1.0 g魚/L,西安市草灘第一漁場(chǎng)提供;大型溞(Daphnia magnaStraus):溞種由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究中心提供,孤雌繁殖;斜生柵藻(Scenedesmusobliquus):藻種由中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究所淡水藻種庫(kù)提供;40%血根堿母藥試樣由陜西先農(nóng)生物科技有限公司提供。

為充分保障試驗(yàn)動(dòng)物福利,參試動(dòng)物均按《GB/T 3170-2004化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》《NY/T 1906-2010 農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范》馴養(yǎng),試驗(yàn)結(jié)束時(shí),所有給藥動(dòng)物,鳥采取CO2麻醉,魚和溞采取電擊,蜂和蠶采取先乙醚麻醉后冷凍安樂(lè)死。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)鳥類的毒性 將40%血根堿母藥用蒸餾水稀釋成38.7、46.4、55.7、66.6、80.0 g/L 5個(gè)質(zhì)量濃度處理藥液,選用馴養(yǎng)好的體質(zhì)量為(100±10)g 的日本鵪鶉,每組10 只,雌雄各5只,用移液管按100 g體質(zhì)量鵪鶉灌藥1 m L供試藥液,對(duì)鵪鶉直接經(jīng)口灌胃染毒,得387、464、557、666、800 mg/kg 5個(gè)組處理。鵪鶉經(jīng)口染毒后,投放入觀察用鳥籠,正常飼喂。于藥后24、48、72、96、120、144、168 h 觀察各組受試鵪鶉中毒癥狀與死亡情況,記錄死亡數(shù),每隔24 h取出死亡鵪鶉。設(shè)置空白對(duì)照,對(duì)照組和處理組均不設(shè)重復(fù)。

1.2.2 對(duì)家蠶的毒性 將40%血根堿母藥用蒸餾水稀釋成100、200、400、800、1 600 mg/L 5個(gè)質(zhì)量濃度處理藥液,把新鮮桑葉分別用各質(zhì)量濃度藥液完全浸漬10 s后,取出,自然晾干,放入相應(yīng)標(biāo)記并墊有濾紙片的9 cm 培養(yǎng)皿中,每培養(yǎng)皿接入20頭2齡起幼蠶,任其自由取食,測(cè)定對(duì)家蠶的胃毒毒性。于藥后24、48、72、96 h觀察各組受試家蠶中毒癥狀與死亡情況,記錄死亡數(shù),每隔24 h取出死亡家蠶。設(shè)置空白對(duì)照,每處理3次重復(fù),每次重復(fù)20頭蠶。

1.2.3 對(duì)蜜蜂毒性 經(jīng)口毒性:將40%血根堿母藥用蒸餾水稀釋成1.25、2.5、5、10、20 g/L 5個(gè)質(zhì)量濃度藥液,分別和100%蔗糖水按體積比1∶1混合,得質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 g/L的飼喂染毒蔗糖水,作為處理溶液。把供試蜜蜂放入CO2麻醉裝置,麻醉后(約2 min)引入試驗(yàn)籠中,在飼喂器中加入100μL染毒蔗糖水處理溶液(蜜蜂理論取食劑量分別為每蜂6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg,飼喂試驗(yàn)蜜蜂,4 h后去掉含藥液飼喂器(稱量飼喂前后飼喂器質(zhì)量,計(jì)算蜜蜂實(shí)際取食藥劑質(zhì)量),換用無(wú)毒50%蔗糖水持續(xù)飼喂,直到試驗(yàn)結(jié)束。于試驗(yàn)開(kāi)始后24、48 h 觀察各組受試蜜蜂中毒癥狀與死亡情況。設(shè)置空白對(duì)照,每處理3 次重復(fù),每次重復(fù)10只蜜蜂。

接觸毒性:將40%血根堿母藥用丙酮稀釋成5、10、20、40、80 g/L 5個(gè)質(zhì)量濃度處理藥液,把供試蜜蜂放入CO2麻醉裝置,麻醉后(約2 min)取出,用微量點(diǎn)滴儀吸取各質(zhì)量濃度藥液,于蜜蜂中胸背板處點(diǎn)滴1μL,蜜蜂接觸劑量分別為5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/蜂,待蜂身晾干后,將受毒蜜蜂轉(zhuǎn)移到試驗(yàn)觀察用蜂籠內(nèi),用50%蔗糖水飼喂試驗(yàn)蜜蜂,直到試驗(yàn)結(jié)束。于藥后24 h和48 h 觀察各組受試蜜蜂中毒癥狀與死亡情況。設(shè)置空白和丙酮對(duì)照,每處理3次重復(fù),每次重復(fù)10只蜜蜂。

1.2.4 對(duì)斑馬魚的毒性 將40%血根堿母藥用曝氣自來(lái)水稀釋成0.500、0.600、0.720、0.865、1.040 mg/L 5個(gè)質(zhì)量濃度的處理藥液,每燒杯加入2 L 藥液,分別投入10尾斑馬魚,采用半靜態(tài)法,每隔24 h更換1次藥液,直到試驗(yàn)結(jié)束。于試驗(yàn)開(kāi)始后24、48、72、96 h觀察各組受試斑馬魚中毒癥狀與死亡情況,及時(shí)打撈死魚。設(shè)置曝氣自來(lái)水空白對(duì)照,對(duì)照組和處理組均不設(shè)重復(fù)。

1.2.5 對(duì)大型溞的毒性 將40%血根堿母藥用曝氣自來(lái)水稀釋成0.20、0.30、0.45、0.67、1.00 mg/L 5個(gè)質(zhì)量濃度的處理藥液,每燒杯加入100 m L藥液,分別投入10只幼溞,采用靜態(tài)法,試驗(yàn)期間不曝氣、不喂食,直到試驗(yàn)結(jié)束。于試驗(yàn)開(kāi)始后24和48 h觀察各組試驗(yàn)溞中毒癥狀與活動(dòng)受抑制情況。設(shè)置曝氣自來(lái)水空白對(duì)照,每處理4次重復(fù),每次重復(fù)10只幼溞。

1.2.6 對(duì)斜生柵藻的毒性 將40%血根堿母藥用無(wú)菌水生培養(yǎng)基稀釋成60、120、240、480、960 μg/L 5個(gè)質(zhì)量濃度的處理藥液,再與1.0×104個(gè)/m L濃度的藻液按比1∶1等體積混合,得到30、60、120、240、480μg/L 5 組質(zhì)量濃度的處理藻液,按每瓶100 m L 藻液加入150 m L 錐形瓶中,常規(guī)培養(yǎng),直到試驗(yàn)結(jié)束。于試驗(yàn)開(kāi)始后24、48、72 h觀察各組試驗(yàn)藻生長(zhǎng)受抑制情況。設(shè)置培養(yǎng)基空白對(duì)照,每處理3次重復(fù),于試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)儀器測(cè)定各組藻液的實(shí)際血根堿質(zhì)量濃度,用于結(jié)果計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)半數(shù)致死濃度(LC50)、半數(shù)致死劑量(LD50)和半數(shù)有效濃度(EC50)、生長(zhǎng)率抑制有效濃度(ErC50)、生物量抑制有效濃度(EyC50)及置信限采用SPSS 18.0 軟件中概率回歸分析計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 血根堿對(duì)鳥類的毒性

鵪鶉經(jīng)口染毒后,中毒癥狀為站立不穩(wěn)、精神萎靡、攝食攝水減少。連續(xù)觀察1周,結(jié)果表明,鵪鶉死亡率與給藥質(zhì)量濃度呈正相關(guān),且自給藥后第3 天起死亡率不再增加;空白對(duì)照受試鵪鶉生長(zhǎng)正常,未出現(xiàn)死亡情況。由表1可知,血根堿對(duì)日本鵪鶉急性經(jīng)口毒性7 d-LD50=556 mg/kg體重,95%置信限=435～712 mg/kg體重。按照《GB/T 3170.9-2004化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)鳥類的急性經(jīng)口毒性劃分等級(jí),屬“低毒”級(jí)(7 d的LD50>500 mg/kg體重)。

表1 血根堿對(duì)日本鵪鶉急性經(jīng)口毒性Table 1 Toxicity of sanguinarine to Coturnix japonica

2.2 血根堿對(duì)家蠶的毒性

家蠶對(duì)藥劑處理后桑葉取食正常,說(shuō)明血根堿無(wú)拒食作用;中毒后表現(xiàn)為體縮、晃頭,扭曲,側(cè)倒。連續(xù)觀察96 h,結(jié)果表明,家蠶死亡率與給藥質(zhì)量濃度、取食染毒桑葉時(shí)間呈正相關(guān),自給藥后死亡率隨時(shí)間增加;空白對(duì)照受試家蠶取食生長(zhǎng)正常,未出現(xiàn)死亡情況。由表2可知,血根堿對(duì)家蠶急性毒性96 h的LC50=680 mg/L,95%置信限=514～975 mg/L。按照《GB/T 3170.11-2004化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)家蠶的急性毒性劃分等級(jí),屬“低毒”級(jí)(96 h的LC50>200 mg/L)。

表2 血根堿對(duì)3種非靶標(biāo)生物的急性毒性Table 2 Acute toxicity of sanguinarine to three non-target organisms

2.3 血根堿對(duì)斑馬魚的毒性

魚苗投入藥液后,0.5、0.6、0.72 mg/L 處理組試驗(yàn)魚集群游動(dòng),0.865、1.04 mg/L 處理組試驗(yàn)魚游動(dòng)緩慢,并出現(xiàn)側(cè)游、沉底現(xiàn)象。連續(xù)觀察至96 h,5個(gè)處理濃度均出現(xiàn)試驗(yàn)魚游動(dòng)緩慢、側(cè)游和死亡癥狀,空白對(duì)照試驗(yàn)魚活動(dòng)正常,未出現(xiàn)死亡情況。由表2可知,血根堿對(duì)斑馬魚急性毒性96 h-LC50=0.64 mg/L,95% 置信限=0.49～0.74 mg/L,按照《GB/T 3170.12-2004化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)魚類的急性毒性劃分等級(jí),屬“高毒”級(jí)(0.100 mg/L

2.4 血根堿對(duì)大型溞的毒性

大型溞中毒癥狀表現(xiàn)為活動(dòng)緩慢,連續(xù)觀察48 h,5個(gè)處理濃度均存在活動(dòng)受抑制的大型溞,空白對(duì)照大型溞活動(dòng)正常。由表2可知,血根堿對(duì)大型溞急性運(yùn)動(dòng)抑制毒性48 h-EC50=0.34 mg/L,95%置信限=0.26～0.45 mg/L。按照《GB/T 3170-132004化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)大型溞的急性運(yùn)動(dòng)抑制毒性劃分等級(jí),屬“高毒”級(jí)(0.100 mg/L

2.5 血根堿對(duì)斜生柵藻的毒性

在試驗(yàn)結(jié)束時(shí),對(duì)照組、藥液濃度在240 μg/L及以下的各處理組為肉眼可見(jiàn)的綠色,其中對(duì)照組顏色最深;藥液濃度為480μg/L的處理組仍為無(wú)色,顯微鏡下觀察,可見(jiàn)部分藻細(xì)胞體積膨脹、細(xì)胞核輪廓模糊、細(xì)胞碎片。以實(shí)測(cè)血根堿處理濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、藥后72 h生長(zhǎng)率和生物量抑制率為縱坐標(biāo),由表3可知,得血根堿對(duì)斜生柵列藻抑制毒性72 h-ErC50=285μg/L,95%置信限=225～359μg/L;72 h-EyC50=61.1μg/L,95%置信限=50.1～74.7μg/L。按照《GB/T 3170.14-2004化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)藻類毒性劃分等級(jí),屬“高毒”級(jí)(EC50≤300μg/L)。

表3 血根堿對(duì)斜生柵列藻的急性毒性Table 3 Acute toxicity of sanguinarine to S.obliquus

2.6 血根堿對(duì)蜜蜂的毒性

蜜蜂中毒癥狀為爬行緩慢、精神萎靡不振、圍繞打轉(zhuǎn),死亡時(shí)雙翅展開(kāi)、喙伸出、腹部向前勾。連續(xù)觀察48 h,結(jié)果表明,試驗(yàn)中蜜蜂死亡率與接觸、取食血根堿劑量、時(shí)長(zhǎng)呈正相關(guān),死亡率逐漸增加;空白、丙酮對(duì)照受試蜜蜂活動(dòng)正常,未出現(xiàn)死亡情況。由表4可知,得血根堿對(duì)蜜蜂急性接觸48 h-LD50=37.7 μg/蜂,95%置信限=24.8～73.2μg/蜂;血根堿對(duì)蜜蜂急性經(jīng)口48 h-LD50=46.2μg/蜂,95%置信限=31.5～82.7 μg/蜂。按照《GB/T 3170.10-2004 化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)蜜蜂的急性毒性劃分等級(jí),均屬“低毒”級(jí)(48 h-LD50>11.0 μg/蜂)。

表4 血根堿對(duì)蜜蜂的急性毒性Table 4 Toxicity of sanguinarine to Apis mellifera

3 結(jié)論與討論

本研究測(cè)定血根堿對(duì)6種環(huán)境非靶標(biāo)生物的安全性,明確血根堿對(duì)環(huán)境有益生物蜜蜂、鳥類、家蠶低毒,對(duì)魚類、溞類、藻類的毒性高毒,具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性,這對(duì)血根堿后續(xù)田間應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支撐。

因?yàn)樵醋蕴烊?傳統(tǒng)觀念認(rèn)為植物源農(nóng)藥低毒、對(duì)非靶標(biāo)生物安全,但植物源農(nóng)藥并非對(duì)所有的非靶標(biāo)生物都具有生物合理性,因其自身特性,有些對(duì)特定非靶標(biāo)生物毒性并不低,如印楝素對(duì)鳥類高毒、魚藤酮對(duì)魚類劇毒、除蟲菊素對(duì)魚類高毒、蝥素乳對(duì)蝌蚪中毒[14-16]。血根堿是從多年生草本植物博落回中提取分離得到的異喹啉類生物堿,具有較好的殺蟲、殺菌活性[5-6]。目前,農(nóng)藥領(lǐng)域?qū)ρ鶋A的研究多集中在生物活性、作用機(jī)理、哺乳動(dòng)物毒性等方面[7-8],其對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究中血根堿對(duì)斑馬魚、大型溞、斜生柵列藻均表現(xiàn)為高毒,表明其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)以旱田作物有害生物防治為主,相關(guān)農(nóng)藥產(chǎn)品使用時(shí)應(yīng)盡量遠(yuǎn)離水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)、河塘等水體附近施藥,禁止在河塘等水體中清洗施藥器具,以降低其對(duì)水生環(huán)境非靶標(biāo)生物的影響。此外,國(guó)家近年來(lái)不斷加強(qiáng)對(duì)植物源農(nóng)藥登記的環(huán)境有益生物安全評(píng)價(jià)政策要求,科研院所、農(nóng)藥企業(yè)在開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥產(chǎn)品時(shí),應(yīng)充分考慮這一因素,以免最后登記受阻。同時(shí),隨著農(nóng)藥減量增效技術(shù)的推廣,大量生物源農(nóng)藥替代化學(xué)農(nóng)藥得到應(yīng)用,但使用者對(duì)生物源農(nóng)藥對(duì)有益生物的影響關(guān)注較少,對(duì)環(huán)境造成潛在威脅[14]。因此開(kāi)展植物源農(nóng)藥對(duì)非靶標(biāo)生物的安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。