KLF2介導自噬對顱內動脈瘤血管平滑肌細胞表型調節的影響

陳 博，汪玲果，藺鵬楨

顱內動脈瘤是一種嚴重的神經系統疾病，病人生存率低且預后差。一般認為顱內動脈瘤是由血管畸形引起的，顱內動脈瘤患病率約為3.2%[1]。除有顱內動脈瘤的家族史外，其他一些因素(吸煙、高血壓和過量飲酒)也會影響顱內動脈瘤形成和生長。有研究顯示，內在因素如血管細胞功能障礙、血管壁退行性變化、炎癥和免疫反應在顱內動脈瘤的發展中發揮一定的作用[2]。Krüppel樣轉錄因子(Krüppel-like factor，KLF)在哺乳動物中有17個成員，介導各種重要的生理和病理過程。Krüppel樣轉錄因子2(Krüppel-like factor 2，KLF2)通常在內皮細胞表達，調節細胞形態和周期[3]。KLF2在動脈粥樣硬化研究中被廣泛應用，并可調節內皮細胞的多個基因表達，包括內皮素、內皮型一氧化氮合酶和基質金屬蛋白酶(MMP)等[4]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)可能具有較大的表型變化，如從收縮相關的細胞變為對環境刺激具有基質重塑的細胞[5]。有研究顯示，顱內動脈瘤的形成涉及血管平滑肌解離，因此，認為血管平滑肌的增殖和遷移是顱內動脈瘤發病機制的關鍵[6]。然而關于KLF2在顱內動脈瘤中的研究較少。本研究首先檢測KLF2在顱內動脈瘤組織中的表達，利用shRNA轉染VSMCs以構建KLF2低表達的穩定細胞株，觀察沉默KLF2對VSMCs增殖、遷移、自噬及表型調節的影響，為KLF2在顱內動脈瘤進展中的作用及其作為新的治療靶標提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 臨床組織標本的采集 收集我院同期收治的且行開顱夾閉術的顱內動脈瘤病人20例，其中男14例，女6例，年齡(40.38±3.14)歲；所有病人經數字減影血管顯像技術明確診斷為顱內動脈瘤。另選取同期因顳葉癲癇切除的顳葉皮層動脈血管組織20例病人，其中男16例，女4例，年齡(39.65±6.71)歲；術后組織病理檢查為正常動脈組織。顱內動脈瘤病人和顳葉癲癇病人性別、年齡比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。所有病人術前均簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；pcDNA3.1/NC、pcDNA3.1/KLF2、shNC和shKLF2購自上海吉瑪制藥技術有限公司；TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司；LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。8 μm孔徑的Transwell小室購自美國Promega公司；放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒和KLF2抗體購自美國Abcam公司；人平滑肌α肌動蛋白(SM-α actin)抗體、人平滑肌肌球蛋白重鏈(SM-MHC)抗體、MMP-3抗體、腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體和辣根過氧化物酶(IgG-HRP)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 顱內動脈瘤VSMCs分離與鑒定 使用外科眼科剪將新鮮顱內動脈瘤組織剪至1 cm3左右，用胰酶消化，直至組織塊表面出現白色絮狀物。取出組織塊，繼續剪碎，接種于培養瓶中，置于細胞培養箱中孵育8 h后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養。第5天時，去除組織塊，加入含10%胎牛血清的DMEM培養液，每日更換培養液1次。待細胞生長融合至90%時進行傳代。取第3代VSMCs，并在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態，同時進行α-SMA的免疫細胞化學染色對VSMCs進行鑒定。

1.2.2 細胞轉染 ①VSMCs按照1×105個/孔接種在24孔板中，將細胞隨機分為control組、shNC組和shKLF2組。待細胞生長融合至60%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染，其中shNC組和shKLF2組轉染終濃度為50 nmol/L。細胞培養箱中培養6 h后，更換新鮮培養基。48 h后結束培養，收集各組細胞進行后續實驗。②VSMCs按照1×105個/孔接種在24孔板中，將細胞隨機分為control組、pcDNA3.1/NC組、pcDNA3.1/KLF2組和pcDNA3.1/KLF2+3-MA組。待細胞生長融合至60%時，按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染，其中pcDNA3.1/NC組和pcDNA3.1/KLF2組轉染終濃度為50 nmol/L。3-MA在轉染前6 h進行預處理。細胞培養箱中培養6 h后，更換新鮮培養基。48 h后結束培養，收集各組細胞進行后續實驗。

1.2.3 5-乙炔基-2′-脫氧尿苷增殖實驗 VSMCs接種在6孔板中，置于細胞培養箱中孵育。細胞生長融合至60%時，按1.2.2進行轉染。實驗結束后，每孔加入100 μL含50 μmol/L Edu的DMEM完全培養基孵育2 h。之后在4%多聚甲醛中固定30 min，將細胞與2 mg/mL甘氨酸孵育10 min。將細胞用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗，之后使用500 μL 0.5% Triton-X透化10 min，在黑暗中與Apollo染色溶液孵育30 min。最終將細胞與Hoechst孵育30 min，并使用0.5% Triton-X沖洗2次。熒光顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.2.4 Transwell細胞遷移實驗 各組轉染48 h后，應用胰酶消化后制成單細胞懸液，細胞密度為1×106個/mL。Transwell小室的上室中加入細胞懸液100 μL，下室中加入含10%胎牛血清的完全培養基500 μL。將Transwell小室置于細胞培養箱中孵育12 h。取出小室，使用棉簽輕輕擦去基底膠和上表面的細胞，之后使用中性甲醛固定，蘇木素染色。顯微鏡觀察遷移的細胞數量。

1.2.5 實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 組織樣本或細胞中的總RNA使用TRIzol試劑進行提取，提取的總RNA使用紫外分光光度計檢測濃度。提取的總RNA經PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis試劑盒逆轉錄成cDNA；之后使用SYBR Premix EX TaqTMⅡ試劑盒進行qRT-PCR。反應體系：cDNA模板2 ng，正向反向引物各0.8 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O補充至20 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃ 30 s預變性后，變性95 ℃ 5 s，退火55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個循環周期。采用2-△△Ct法分析KLF2 mRNA表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 蛋白免疫印跡法(Western Blotting) 組織樣本或細胞中的總蛋白經RIPA裂解液進行提取，總蛋白含量采用BCA法測定，并將配對的樣品調節至相同濃度。樣品經變性后，采用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，之后將PVDF膜分別與以下抗體4 ℃孵育過夜：KLF2抗體(1∶1 000)，LC3A/B抗體(1∶1 000)，SM-α actin抗體，SM-MHC抗體，MMP-3抗體，TNF-α抗體和GAPDH抗體(1∶2 000)。之后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與IgG-HRP抗體(1∶4 000)孵育1 h，TBST洗滌3次。最后顯影曝光，采用Image-Pro Plus圖像分析系統對蛋白條帶灰度值進行分析。

2 結 果

2.1 KLF2在顱內動脈瘤組織中的表達 與正常組織比較，KLF2 mRNA在顱內動脈瘤組織中表達增加(P<0.001)；與正常組織比較，顱內動脈瘤組織中KLF2蛋白表達水平上調(P<0.001)。詳見圖1。

與正常組織比較，＊P<0.001。

2.2 VSMCs的鑒定結果 免疫細胞化學染色結果表明：光鏡下可見細胞胞漿呈深棕黃色，證實細胞α-SMA抗原表達呈陽性，鑒定細胞為VSMCs。詳見圖2。

圖2 VSMCs中α-SMA的表達(×100)

2.3 沉默KLF2在VSMCs中的表達 與shNC組比較，shKLF2組VSMCs中KLF2 mRNA表達降低(P<0.001)；與shNC組比較，shKLF2組VSMCs中KLF2蛋白表達水平下調(P<0.001)。詳見圖3。

與shNC組比較，#P<0.001。

2.4 沉默KLF2對VSMCs增殖能力的影響 與shNC組比較，shKLF2組VSMCs中Edu陽性細胞比例下降(P<0.01)。詳見圖4。

與shNC組比較，#P<0.01。

2.5 沉默KLF2對VSMCs遷移能力的影響 與shNC組比較，shKLF2組VSMCs遷移細胞數量減少(P<0.001)。詳見圖5。

與shNC組比較，#P<0.001。

2.6 沉默KLF2對VSMCs自噬的影響 與shNC組比較，shKLF2組VSMCs中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比例減少(P<0.001)。詳見圖6。

與shNC組比較，#P<0.001。

2.7 沉默KLF2對VSMCs表型調節的影響 與pcDNA3.1/NC組比較，pcDNA3.1/KLF2組VSMCs中SM-α -actin、SM-MHC蛋白表達水平下調(P<0.001)，MMP-3、TNF-α蛋白表達水平上調(P<0.001)；與pcDNA3.1/KLF2組比較，pcDNA3.1/KLF2+3-MA組VSMCs中SM-α-actin、SM-MHC蛋白表達水平上調(P<0.01)，MMP-3、TNF-α蛋白表達水平下調(P<0.05)。詳見圖7。

與pcDNA3.1/NC組比較，#P<0.001；與pcDNA3.1/KLF2組比較，&P<0.05，&&P<0.01。

3 討 論

顱內動脈瘤是重要的腦血管疾病，患病率為1%～5%。顱內動脈瘤破裂導致蛛網膜下隙出血，急性死亡率約為50%。隨著動脈瘤大小和動脈瘤壁不規則性，顱內動脈瘤破裂風險增加。顱內動脈瘤特征是動脈壁完整性喪失，包括內皮功能障礙、內膜增生、細胞外基質紊亂和炎癥[7]。目前，顱內動脈瘤的臨床治療主要包括手術和血管介入，未發現有效的治療藥物。因此，迫切需要找到新的靶向藥物治療顱內動脈瘤。

KLF是鋅指DNA結合轉錄因子家族的成員，在各個生物學過程(包括增殖、分化、發育、生長和炎癥)中發揮著不同的作用。KLF家族成員的保守程度較高，目前共17個成員(KLF1～KLF17)。該蛋白家族的所有成員串聯在一起包括3個Cys2/His2鋅指基序，其通過與轉錄靶序列的常見DNA區域結合[8]。所有成員中，KLF2因其在淋巴細胞生物學中的作用，特別是其存活、分化和運輸被廣泛研究。除淋巴細胞生物學外，KLF2可調節內皮細胞及單核細胞的促炎激活[9]。Wu等[10]研究顯示，過表達KLF2的人臍靜脈內皮細胞中，核因子E2相關因子(Nrf2)和血紅素氧合酶1(HO-1)表達水平增加，采用Nrf2抑制劑或HO-1 siRNA處理的過表達KLF2人臍靜脈內皮細胞中，KLF2對缺氧/復氧損傷和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)解偶聯的保護作用幾乎消失，因此，KLF2通過調節Nrf2/HO-1途徑的eNOS解偶聯在缺氧/復氧誘導的人臍靜脈內皮細胞損傷中發揮著保護作用。但KLF2在顱內動脈瘤中研究較少。因此，本研究檢測顱內動脈瘤組織中KLF表達，結果表明，KLF2在顱內動脈瘤組織中高表達。

VSMCs在各種疾病中具有高度的可塑性[11]。正常生理狀態下，VSMCs具有維持血壓平衡、調節血管張力和血流量等功能。正常生理狀態發生變化時，VSMCs可發生表型調節，由收縮表型轉變為合成表型[12]，此過程中SM-MHC和SM-α -actin收縮蛋白通常被下調，基質金屬蛋白酶及其他炎癥介質上調。有研究顯示，VSMCs表型調節有利于顱內動脈瘤形成、發展和破裂[13]。Fan等[14]研究表明，miR-331-3p通過在體內下調TNF-α和CD14抑制顱內動脈瘤形成。miR-331-3p維持VSMCs收縮型，因此，可能抑制顱內動脈瘤進展。這些發現為顱內動脈瘤的臨床治療提供新策略。Shi等[15]研究表明，Nrf-2信號傳導通過調節VSMCs表型抑制顱內動脈瘤形成和進展。Nrf-2激動劑tBHQ通過促進Nrf-2核易位降低了顱內動脈瘤形成和破裂的概率，并增加VSMCs收縮基因表達。因此，VSMCs的表型調節在顱內動脈瘤瘤壁的退化和破裂中發揮著重要的作用。

本研究構建了KLF2低表達的穩定VSMCs，發現沉默KLF2使VSMCs細胞增殖能力和遷移能力下降，表明沉默VSMCs可抑制VSMCs細胞活力。同時進行表型調節標志性蛋白檢測，結果表明，沉默KLF2使SM-α-actin、SM-MHC蛋白表達水平上調，MMP-3、TNF-α蛋白表達水平下調，因此，KLF2可抑制VSMCs表型轉化。

自噬是一種自身降解的溶酶體介導過程，在維持細胞穩態中發揮著重要作用。自噬涉及多種血管疾病，包括動脈粥樣硬化、高血壓等[16]。有研究顯示，顱內動脈瘤病人動脈瘤組織中觀察到自噬水平增強，尤其在動脈瘤破裂病人中，且自噬在調節VSMCs表型和生存能力中發揮著重要的作用[17]。Gao等[18]研究顯示，miR-4735通過調節自噬促進VSMCs增殖和遷移，在顱內動脈瘤表型調節中發揮著重要作用。因此，抑制自噬可防止表型改變[19]。本研究結果顯示，沉默KLF2可抑制VSMCs自噬，進而可能防止VSMCs的表型轉化。

綜上所述，KLF2在顱內動脈瘤組織中高表達；沉默KLF2抑制血管平滑肌細胞的增殖、遷移和自噬，從而抑制血管平滑肌細胞的表型調節。因此，KLF2具有作為診斷顱內動脈瘤生物標志物的潛在價值，可能成為顱內動脈瘤治療的靶標。