黃連溫膽湯調控PI3K/Akt/mTOR信號通路干預ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的作用機制

楊金果，鞠建慶，湯獻文，嚴權浩

隨著社會老齡化加重及居民不健康生活方式，我國心血管疾病發病率、死亡率持續升高，疾病負擔日漸加重，防治心血管疾病刻不容緩[1]。動脈粥樣硬化是動脈粥樣硬化性心血管病的重要病理基礎[2]。既往研究表明，抑制磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物西羅莫司靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路可誘導巨噬細胞自噬，減輕炎癥反應，延緩動脈粥樣硬化進展。黃連溫膽湯是治療動脈粥樣硬化性心血管疾病的常用復方，動物實驗表明，其具有降低血脂水平，減小主動脈斑塊面積和抑制動脈粥樣硬化病程進展的作用[3]。黃連溫膽腸能否通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路發揮抗動脈粥樣硬化作用的研究報道較少。本研究采用黃連溫膽湯為干預措施，高脂飼料飼養的載脂蛋白E(ApoE)-/-小鼠為動脈粥樣硬化動物模型，探討黃連溫膽湯對動脈粥樣硬化的干預效應及其與PI3K/Akt/mTOR信號通路的關系，以期揭示黃連溫膽湯干預動脈粥樣硬化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7～8周齡無特定病原體(SPF)級ApoE-/-小鼠30只，相同周齡C57BL/6J小鼠6只，雄性，體質量(25±5)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006，批號：1100111911017204。高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：京飼證(2014)06057，批號：1103221900009954。

1.2 實驗藥物與試劑 黃連溫膽湯組方：黃連10 g，半夏15 g，竹茹10 g，枳實15 g，陳皮15 g，茯苓15 g，生姜5 g，炙甘草5 g，水煎2次合并濃縮為1 g/mL，置于4 ℃保存備用。雷帕霉素(aladdin，批號：CAS53123-8)；氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司生產，批號：H13023201)；三酰甘油(TG)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產，批號20190810)；總膽固醇(TC)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產，批號20190810)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產，批號20190810)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司生產，批號20190810)；Anti-PI3K抗體(美國Abcam，批號ab182651)，Anti-Akt1/Akt2/Akt3抗體(美國Abcam，批號ab179463)，Anti-mTOR抗體(美國Abcam，批號ab32028)。

1.3 實驗儀器 電子天平(Sartorius公司，型號：BSA3202S-CW)，小動物體重天平(上海越平科學儀器有限公司，型號：YP1002)；邁瑞BS-420全自動生化儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；高清成像系統，佳能(Canon)EOS 5D。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗造模、分組及給藥 ApoE-/-小鼠30只，適應性飼養1周，給予高脂飼料飼養4周，建立動脈粥樣硬化模型[4-6]，隨機分為模型組、雷帕霉素組[4 g/(kg·d)]、黃連溫膽湯低劑量組[9 g/(kg·d)]、黃連溫膽湯中劑量組[18 g/(kg·d)]、黃連溫膽湯高劑量組[36 g/(kg·d)]，每組6只小鼠。同時選取雄性C57BL/6J小鼠6只作為對照組，給予普通飼料飼養。各給藥組給予相應藥物灌胃，對照組、模型組給予等體積純凈水灌胃。4周后處死小鼠取材。

1.4.2 觀察指標

1.4.2.1 血脂 從小鼠眼球靜脈叢取血，將離心管靜置室溫2 h，待血液凝固成血塊收縮后，3 000 r/min離心10 min，取上清液于離心管中，采用全自動生化分析儀檢測小鼠血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.4.2.2 病理學染色 蘇木精-伊紅(HE)染色：取小鼠主動脈根部組織，石蠟包埋，切片，脫蠟，覆水，蘇木素染液染色5 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化3～5 s，返藍，0.5%伊紅染液染色1 min，脫水封片。Masson染色：取小鼠主動脈根部組織石蠟包埋，切片，脫蠟，Masson染色試劑盒內Weigert氏鐵蘇木素染5 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化數秒，流水沖洗數分鐘返藍，麗春紅酸性品紅液染5～10 min，蒸餾水快速漂洗，磷鉬酸水溶液處理3～5 min，苯胺藍液復染5 min，1%冰醋酸分化處理1 min，脫水封片。油紅O染色：取小鼠主動脈根部組織取材后使用OCT包埋，進行6～8 μm冰凍切片，之后將組織粘貼于載玻片上，蒸餾水沖洗，油紅O工作液10～15 min，75%乙醇分化2 s，水洗，蘇木素1～2 min，水洗，鹽酸乙醇分化，返藍，水洗，紙巾擦去周圍水，甘油明膠封片。

觀察、拍照并采用Image-pro-plus 6.0對圖像進行分析。主動脈根部斑塊面積即主動脈根部脂質面積與管腔面積百分比，膠原纖維含量即膠原纖維面積與血管總面積(含斑塊)百分比。

1.4.2.3 免疫組化法檢測PI3K、Akt、mTOR蛋白表達 取小鼠主動脈根部組織并用石蠟常規切片，脫蠟，蒸餾水沖洗3 min，3次，3% H2O2封閉內源性過氧化物酶，微波加熱抗原修復，10%正常羊血清孵育，滴加一抗，4 ℃冰箱中過夜，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)振蕩清洗后分別滴加二抗、三抗，DAB顯色，蘇木素復染，常規封片，觀察后拍照。采用Image-pro-plus 6.0對圖像進行分析。

2 結 果

2.1 黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠血脂水平的影響 與對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C升高，HDL-C降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組TG降低(P<0.05)，TC、LDL-C有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯中劑量組LDL-C、TG降低(P<0.05)，TC有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯高劑量組TC、TG、LDL-C均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組、黃連溫膽湯高劑量組HDL-C比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見圖1。

與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，＊P<0.05。

2.2 黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊病理形態學的影響 主動脈根部HE染色顯示：對照組小鼠主動脈根部血管壁層次清晰，內膜平滑完整，無粥樣斑塊沉積。模型組與各給藥組小鼠主動脈根部均有不同程度的粥樣斑塊沉積。模型組易損斑塊特征明顯，管壁彌漫性增厚，斑塊體積大，斑塊內脂核大、數量多，可見大量泡沫細胞和膽固醇結晶沉積，纖維帽細薄或不連續，中膜變薄；各給藥組小鼠主動脈根部斑塊面積減小，病變較局限，粥樣斑塊纖維帽厚，脂核小，泡沫細胞及膽固醇結晶少，斑塊趨于穩定。詳見圖2。

圖2 各組小鼠主動脈根部HE染色圖(A為對照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

2.3 黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊面積的影響 油紅O染色顯示：對照組小鼠主動脈根部血管內膜光滑完整，未見動脈粥樣硬化斑塊；與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組主動脈根部斑塊面積有減小趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)；雷帕霉素組、黃連溫膽湯高劑量組較模型組主動脈根部斑塊面積減小(P<0.05)；但雷帕霉素組與黃連溫膽湯高劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 各組主動脈根部油紅O染色圖(A為對照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

與模型組比較，＊P<0.05。

2.4 黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠主動脈根部斑塊中膠原纖維含量的影響 Masson染色顯示，與模型組比較，黃連溫膽湯低劑量組、黃連溫膽湯中劑量組小鼠主動脈根部膠原纖維含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)；但雷帕霉素組、黃連溫膽湯高劑量組較模型組膠原纖維含量升高(P<0.05)；雷帕霉素組、黃連溫膽湯高劑量組膠原纖維含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖5、圖6。

圖5 各組主動脈根部Masson染色圖(A為對照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

與模型組比較，＊P<0.05。

2.5 黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達的影響 與模型組比較，雷帕霉素組、黃連溫膽湯中劑量組和黃連溫膽湯高劑量組小鼠主動脈PI3K、Akt、mTOR蛋白表達水平均降低，差異有統計學意義(P<0.05)，黃連溫膽湯低劑量組有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖7～圖10。

圖7 各組主動脈根部病變區PI3K蛋白免疫組化染色圖(A為對照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

圖8 各組主動脈根部病變區Akt蛋白免疫組化染色圖(A為對照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

圖9 各組主動脈根部病變區mTOR蛋白免疫組化染色圖(A為對照組；B為模型組；C為雷帕霉素組；D為黃連溫膽湯低劑量組；E為黃連溫膽湯中劑量組；F為黃連溫膽湯高劑量組)

與模型組比較，＊P<0.05。

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種好發于大動脈、中動脈的血管壁慢性炎癥病變，發病機制復雜。PI3K/Akt/mTOR信號通路是一條經典的促存活和抗凋亡的信號傳導通路，在自噬中發揮核心和關鍵的調節作用[7-8]。其中PI3K是上游關鍵分子，負調節自噬，可連接到細胞膜上，進而激活Akt；活化的Akt可解除下游結節硬化復合物對mTOR的抑制作用，增加mTOR活性；活化的mTOR是自噬相關信號通路的核心，可抑制由多種誘因導致的細胞自噬。PI3K/Akt/mTOR信號通路通過調控細胞生存、增殖、凋亡等，參與高血壓、冠心病、腫瘤等多種疾病的病理損傷過程。相關研究顯示，PI3K/Akt/mTOR信號通路是動脈粥樣硬化形成的重要信號傳導通路，選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，可誘導巨噬細胞自噬，減少斑塊巨噬細胞浸潤，抑制炎癥反應，繼而穩定動脈粥樣硬化易損斑塊[9-11]。目前已知某些中藥有效成分通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，調控巨噬細胞發揮自噬抗動脈粥樣硬化。滿藝璁等[12]研究顯示，化瘀祛痰方通過PI3K/Akt/mTOR信號通路調控動脈粥樣硬化家兔肝臟自噬穩態，減緩肝臟脂質損傷，從而改善動脈粥樣硬化。張志鑫等[13]研究顯示，黃芪甲苷通過調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制炎癥反應，發揮抗動脈粥樣硬化的作用。

中醫學中無“動脈粥樣硬化”病名，根據病人臨床表現，歸屬于“眩暈”“頭痛”“中風”“胸痹”“脈痹”等病癥范疇，病機屬本虛標實，本虛包括氣虛、陰虛、陽虛，標實包括血瘀、痰濁、寒凝、氣滯、熱毒，其中痰濁和熱毒是防治動脈粥樣硬化的重要病理因素，痰熱互結是嶺南地區常見病機之一[14]。黃連溫膽湯出自清代陸廷珍的《六因條辨》，由宋代醫學家陳言《三因極一病癥方論》中記載的溫膽湯基礎上去大棗加黃連而成，藥物組方為黃連、半夏、竹茹、枳實、陳皮、炙甘草、茯苓、生姜，主要功效為清熱、燥濕、化痰，臨床廣泛用于內科雜病的治療，亦是治療動脈粥樣硬化痰熱互結證的代表復方[15]。朱瑞等[16]研究顯示黃連溫膽湯治療冠心病心絞痛療效顯著。燕珊等[3]動物實驗表明，黃連溫膽湯具有降低血脂水平、減小主動脈斑塊面積和抑制動脈粥樣硬化病程進展的作用。

本研究以高脂飼料飼養ApoE-/-小鼠構建動脈粥樣硬化模型，探討黃連溫膽湯是否通過PI3K/Akt/mTOR途徑發揮抗動脈粥樣硬化的作用，結果顯示，黃連溫膽湯干預后小鼠血清TG、TC、LDL-C較模型組降低，表明黃連溫膽湯可降低小鼠血清TG、TC、LDL-C水平，調節脂質代謝。HE染色、油紅O、Masson染色顯示：模型組小鼠主動脈根部斑塊面積增大，脂質含量增多，纖維膠原含量減少，泡沫細胞聚集，且脂核大，纖維帽變薄，斑塊不穩定。藥物干預后，黃連溫膽湯高劑量組小鼠主動脈根部斑塊面積比例減小，膠原纖維含量增加，斑塊趨于穩定，表明黃連溫膽湯具有抗動脈粥樣硬化、穩定易損斑塊的作用。雷帕霉素組、黃連溫膽湯中劑量組、黃連溫膽湯高劑量組小鼠主動脈根部PI3K、Akt、mTOR蛋白表達較模型組降低，表明黃連溫膽湯可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，誘導巨噬細胞自噬而發揮抗動脈粥樣硬化，穩定易損斑塊的作用。

綜上所述，黃連溫膽湯對ApoE-/-小鼠具有良好的降脂及抗動脈粥樣硬化，穩定易損斑塊作用，其機制可能與調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，誘導巨噬細胞自噬，減輕動脈粥樣硬化斑塊內脂質負荷和炎癥反應有關。