轉基因大豆MON87751品系特異性實時熒光定量PCR檢測方法建立

劉二龍 鄭冠津 王毅謙 李志勇 魏霜 關麗軍 盧麗 蔣湘 劉金華 王振華

摘要 [目的]為完善我國轉基因檢測方法體系，建立轉基因大豆MON87751品系特異性實時熒光聚合酶鏈式反應（real time polymerase chain reaction，PCR）檢測方法。[方法]根據MON87751的3′端鄰接區序列設計特異性引物和探針，建立MON87751品系特異性實時熒光PCR檢測方法，并測定該方法的靈敏度、特異性及可重復性。[結果]靈敏度測試顯示，其定量下限為40拷貝;重復性試驗顯示其相對標準偏差在可接受范圍內。[結論]該研究建立的MON87751品系特異性實時熒光PCR檢測方法特異性良好，靈敏度高，有良好的可重復性，適合對轉基因大豆MON87751品系進行檢測鑒定。

關鍵詞 實時熒光PCR;轉基因大豆MON87751;品系特異性

中圖分類號 S 565.1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）04-0102-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishing an Event-specific Real-time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Genetically Modified Soybean Event MON87751

LIU Er-long1，ZHENG Guan-jin1，WANG Yi-qian2 et al （1.Huangpu Customs Technology Center，Guangzhou，Guangdong 510730;2.Animal Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract [Objective]In order to improve the genetically modified detection method system in China，a real-time polymerase chain reaction （PCR） detection method specific to the genetically modified soybean MON87751 was established.[Method]The specific primer pairs and probe based on the sequence of the 3' adjacent region of MON87751 were designed and then the real-time PCR detection method was established.The specificity，sensitivity and repeatability were analyzed.[Result]The real-time PCR method was specific for detecting MON87751.The limit of quantification （LOQ） was 40 copies MON87751 genomic DNA.Repeatability of the established event-specific real-time PCR method was assessed and the relative standard deviation （RSD） was within the acceptable range.[Conclusion]The established event-specific quantitative real-time PCR method of MON87751 has good specificity，high sensitivity and good reproducibility，and is suitable for the identification of soybean MON87751.

Key words Quantitative real-time PCR;Genetically modified soybean MON87751;Event-specificity

基金項目 廣東省科技計劃項目（2017B020207008）;廣州市科技計劃項目（201704030125）;國家重點研發計劃（2018YFF0215605）;南京海關科技計劃項目（2021KJ18）。

作者簡介 劉二龍（1978—），男，湖南郴州人，高級獸醫師，碩士，從事動植物分子鑒定研究。*通信作者，博士，從事食品安全快速檢測技術研究。

收稿日期 2021-04-06;修回日期 2021-05-24

大豆是一種富含蛋白與脂肪的糧食及油料作物。我國是世界大豆第一消費國和進口國，國產大豆難以滿足國內市場消費需求，故而大豆貿易逆差大，2019年大豆進口量為8 851萬t[1]。

轉基因大豆MON87751由孟山都公司研發，其含有穩定整合的cry1A.105和cry2Ab2表達盒[2]，主要產生Cry1A.105和Cry2Ab2兩種針對鱗翅目害蟲的殺蟲蛋白。MON87751于2014年在美國上市，目前在歐盟、澳大利亞、新西蘭、加拿大、日本、韓國、中國臺灣和美國等國家或地區獲得批準允許用作食品、飼料或種植。為完善我國轉基因產品檢測技術體系，為轉基因產品的監管提供強有力的技術支持，筆者采用實時熒光PCR技術平臺，根據MON87751 3′端鄰接區序列設計引物、探針，建立了MON87751品系特異性檢測方法，以期為實現高通量的檢測提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

轉基因油菜MON88302、轉基因棉花MON88913、轉基因油菜DP-073496-4、轉基因大豆A2704-12、轉基因大豆GTS 40-30-2、轉基因甜菜H7-1、轉基因玉米MON810、轉基因玉米NK603、轉基因玉米BT11、轉基因玉米MIR162、非轉基因大豆為黃埔海關技術中心購置及保存;大豆內源基因植物凝集素基因（Lectin基因）和MON87751品系特異性外源基因雙基因陽性質粒為黃埔海關技術中心構建。

主要試劑：Primex Ex Taq（2×） for qPCR（TAKARA）;引物和探針工作液的終濃度為10 μmol/L（上海閃晶生物）;DNA提取試劑盒DP-305（北京天根）。

主要設備：實時熒光PCR儀ABI7500fast、ABI7500（美國應用生物系統公司）;研磨機Tube Mill 100 control（德國IKA）;微量分光光度計 nanodrop2000c（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。稱取100 mg研磨成粉末狀的樣品提取樣品中的基因組DNA，測定DNA濃度并于4℃保存備用。

1.2.2 引物組和探針設計。根據轉基因大豆MON87751品系3′端鄰接區序列（品系特異性片段），應用Primer Primer 5.0 軟件設計引物和探針。選用內源基因Lectin用于樣本核酸提取質量監測及定量分析。

1.2.3 實時熒光PCR反應體系退火溫度及引物探針配比的優化。采用TAKARA RR390酶系對不同體積的引物探針進行優化（25 μL體系）。A組：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.5 μL，10 μmol/L探針MON87751-P 1.0 μL，模板2.0 μL和ddH2O 8.3 μL。 B組：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.4 μL，10 μmol/L探針MON87751-P 0.8 μL，模板2.0 μL和ddH2O 8.7 μL。C組：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.2 μL，10 μmol/L探針MON87751-P 0.4 μL，模板2.0 μL和ddH2O 9.5 μL。

退火延伸溫度分別設置為60和58 ℃，反應程序為95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃（58 ℃） 34 s，40個循環，于60 ℃（58 ℃）收集熒光信號。

1.2.4 特異性測試。用“1.2.1”的方法提取“1.1”中樣品DNA為模板，陽性對照為Lectin-MON87751質粒，陰性對照為非轉基因大米DNA，進行特異性測試。

1.2.5 靈敏度測試。

將提取的Lectin-MON87751DNATE緩沖液稀釋至4 000000、400000、40000、4000、400、40和20拷貝/μL進行轉基因大豆MON87751實時熒光PCR檢測，進行靈敏度測試。

1.2.6 可重復性測試及建立標準曲線。

將提取的Lectin-MON87751質粒DNA溶液加入TE緩沖液稀釋至4 000 000、400 000、40 000、4 000、400、40和20拷貝/μL，每個樣品進行3次重復試驗，進行實時熒光PCR檢測線性范圍測試及可重復性測試。

2 結果與分析

2.1 方法的建立及優化

2.1.1 實時熒光PCR引物和探針設計。

通過分析轉基因大豆MON87751 3′端鄰接區序列設計的多組引物和探針，分析引物與探針的反應效率、擴增效果，最終選擇表1中的引物和探針建立MON87751品系特異性檢測方法。

2.1.2 PCR反應體系優化。

在擴增體系的退火溫度為58 ℃時，3組引物探針組B、A和C的擴增曲線均擴增良好，其中Ct值最小為B組（圖1）;溫度為60 ℃時，B、A和C 3組均擴增良好，A和B組Ct值接近，C組Ct稍高，但3組引物探針Ct值較退火溫度為58 ℃時Ct值高（圖2）。因此，基于擴增效率和經濟性，考慮選擇B組體積配比、58 ℃作為退火溫度引物探針配比。

2.2 特異性測試 由圖3可知，采用MON87751品系特異性MON87751-F/R/P引物和探針進行實時熒光PCR時，其他農作物材料DNA為模板的反應均無典型熒光擴增曲線，只有陽性樣品MON87751的DNA模板有典型熒光擴增曲線，表明該研究的檢測方法特異性良好。

2.3 靈敏度測試、可重復性測試及標準曲線建立

按“1.2.5”進行7個濃度梯度擴增，其最低檢測濃度為20拷貝/μL。擴增曲線見圖4。

2.4 標準曲線制備 按“1.2.6”進行轉基因大豆MON87751品系實時熒光PCR檢測，測試結果的Ct值見表2。根據表2中Ct值數據與拷貝數對數值建立線性回歸方程為y=-3.43x+42.12，擴增效率95.55%（90%～110%），R2為0.99，表明該方法的線性相關性良好，擴增效率滿足定量檢測標準的要求（圖5），且在線性范圍內，Ct值的SD為0.04～0.39，RSD為0.20%～1.27%（表2）。最低模板量40拷貝時，其RSD遠小于25%，設定該方法的定量限為40拷貝。

3 討論

目前對轉基因產品多數國家均采用相應的標識管理制度，轉基因產品標識需要檢測方法的支撐。歐盟轉基因食品和飼料基準實驗室有建立MON87751 5′邊界序列的PCR檢測方法[4]，但國內尚缺乏該檢測方法及相關標準。實時熒光定量PCR技術在轉基因檢測中應用廣泛，被譽為“金標準”，其可監測PCR進程中探針發光基團的信號，從而實現定性或定量分析[5-7] 。

品系特異性PCR（Event-specific PCR）檢測方法檢測的目標序列是外源基因與植物基因組間邊界序列，甚至可以區分相同質粒轉化的轉基因品系[8]，品系特異性檢測方法報道較早見于Bt11品系檢測方法的建立[9]，目前在轉基因品系鑒定中應用廣泛[10-15]。

該研究針對轉基因大豆MON87751 3′端邊界特異性序列，基于實時熒光PCR平臺，設計引物和探針建立MON87751品系特異性檢測方法，定量下限為40拷貝，擴增效率為95.55%，重復性測試顯示，各平行間樣品所得Ct的RSD均遠小于25%，表明該方法特異性良好，靈敏度較高，具有良好的穩定性，可為相關部門鑒定檢測轉基因大豆MON87751提供方便快捷的方法。

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