連作煙田健株與感染根腐病煙株根際土壤細菌群落多樣性研究

敖金成 李永梅 李博

摘要：為探明連作與感染根腐病煙株根際土壤細菌群落結構變化，采用Illumina高通量技術對細菌16S rDNA的V3-V4區域進行測序，對比研究連作煙田健株與感染根腐病煙株根際土壤細菌群落結構。結果表明，變形菌門、放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門是連作煙田健株和病株根際土壤主要的細菌優勢種群，相對豐度累計總和為89.1%～93.9%，隨連作年限的延長各優勢種群發生趨向性變化;隨連作年限的延長，健株根際土壤細菌群落豐富度和多樣性呈先增后降趨勢，病株根際土壤細菌群落豐富度和多樣性呈降低趨勢，短期連作（2～4 年）煙田健株和病株根際土壤細菌群落組成較為相似，與連作8年和撂荒2年以上（CK）土壤樣本的細菌群落組成差異較大;冗余分析結果表明，土壤化學因子與細菌群落分布關聯緊密，其中pH值是影響土壤細菌群落分布的核心因子，其貢獻度為15.77%。綜上，連作和染病降低了土壤細菌群落豐富度和多樣性，優勢菌群趨向性演化，有益菌群相對豐度降低。在生產實踐中，提高煙田土壤pH值，降低連作年限并及時清除煙株病殘體有利于維持土壤微生態環境的穩定性。

關鍵詞：高通量測序;連作煙田;細菌群落;冗余分析;根際土壤;多樣性分析

中圖分類號： S154.36;S154.37文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0198-07

收稿日期：2021-05-26

基金項目：國家自然科學基金（編號：32060445、41807524）;云南省自然科學基金（編號：202001AU070114）;廣西中煙工業有限責任公司科技項目（編號：GXZYCX2019b004）。

作者簡介：敖金成（1984—），男，云南曲靖人，博士研究生，高級工程師，主要從事植物營養與病害控制技術研究。E-mail：89693180@qq.com。

通信作者：李永梅，博士，教授，博士生導師，主要從事植物營養與病害控制技術研究。E-mail：youngmaylee@126.com。

烤煙（Nicotiana tobacum L.）是云南重要的經濟作物，是典型的忌連作作物。受土地資源短缺和其他經濟作物種植面積的擠壓，云南烤煙連作現象十分嚴重，多個核心煙區烤煙連作年限多在10年以上。連作引發許多土壤問題[1-4]，加上近年來煙葉秸稈就地粉碎還田帶來的弊端[5]，致使連作煙田土傳病害危害、煙葉產量和品質下降等問題持續加重。煙草病害一直是嚴重制約世界煙草生產和科研發展的重要難題[6]。在諸多的土傳病害中，煙草鐮刀菌根腐病是由鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌引起的一種典型的土傳病害，常與黑脛病、青枯病、黑根腐病復合發生，使得該病具有隱秘性、易混淆、難防治、危害重等特點，近年來全國各煙區發病率呈上升趨勢。探尋有效防控煙草根腐病的方法，是促進煙草產業可持續發展的關鍵。

土壤細菌是土壤養分循環重要的驅動者[7]，具有重要的生態功能[8-9]。連作可以改變根際細菌的群落結構，降低土壤細菌物種數和群落α多樣性[10]。長期連作嚴重影響了土壤理化性質，進而顯著降低了土壤細菌群落和組成多樣性[11]，并且土壤優勢菌門的相對豐度和多樣性存在時空異質性[12]，反映了土壤微生態的復雜性，易受環境因子[13-14]、作物類型[15]、施肥[16]等因素的調控，因而了解土壤細菌群落結構及多樣性對維持土壤生態功能具有重要意義。史普酉等研究指出，不同發病程度煙株根際細菌群落組成和結構發生趨向性變化，土壤生物多樣性降低[17]。煙草鐮刀菌根腐病發病煙株根際真菌群落多樣性顯著降低，病原菌相對豐度顯著高于健康煙株[18]。鄭元仙等研究也指出，煙株根際土壤真菌群落結構改變及物種多樣性降低是根腐病發生的重要特征[19]。然而，關于土壤細菌群落結構及多樣性對連作條件下煙株感染根腐病的響應特征鮮見報道。鑒于此，本研究以不同連作年限煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤為研究對象，探索連作條件下健株和病株根際土壤細菌群落結構及多樣性特征，以期為連作煙田煙草根腐病的科學防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 連作土壤采集區概況

試驗點位于云南省紅河州瀘西縣（103°52′26″E，24°40′03″N），地處滇南低山丘陵烤煙區，地勢平緩，多數栽煙區域海拔在1 100～1 600 m之間，熱量條件優越，降水充沛，年均溫為16.0～18.0℃，烤煙大田生育期降水量在1 000.0 mm左右，是云南省典型的清甜香風格煙葉核心產區，植煙歷史悠久。2010—2020年間，試驗地區域年均溫為15.5 ℃，年均降水量為810.0 mm，年均日照時數為2 042.0 h，海拔為1 803.0 m。

1.2 樣品采集

試驗于2020年7月烤煙成熟期，選取2、4、8 年連作植煙地塊，隨機取健康（以下簡稱為“健株”）和感染根腐病煙株（以下簡稱為“病株”）各4株，去除地表雜物，然后將煙株整株挖起，去除根系外圍土壤，采用抖根法采集根際土[20]，輕輕抖落并收集須根2 mm范圍內的土壤。對照（CK）為同區域撂荒2年以上未種植烤煙的土壤。每株烤煙根際土為1次重復，各4次重復。健株分別編號為HT2、HT4、HT8，病株分別編號為ST2、ST4、ST8。試驗地塊均為同一農戶自己栽種，植煙歷史可考證。供試烤煙品種為云煙87。

1.3 檢測項目及方法

1.3.1 土壤化學性狀 取樣后將樣品帶回實驗室，土壤經風干、磨細、過篩后備用。土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量和pH值的測定參照文獻[21]中的方法。

1.3.2 土壤細菌高通量測序 用于高通量測序的樣本取樣后立即放入冰盒帶回實驗室，于-80 ℃保存備用。基于Illumina高通量測序技術檢測分析連作條件下煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細菌群落結構的豐度和多樣性。

1.3.2.1 基因組DNA的提取 樣本由廣州基迪奧生物科技有限公司平臺（https：//www. Omic-smart.com）檢測。采用HiPure Soil DNA Mini Kits（廣州美基，中國，cat#3412）土壤DNA提取試劑盒進行土壤微生物DNA提取。首先在2 mL 珠管中加入0.25～0.50 g土壤樣品和0.6 mL 緩沖溶液，利用渦旋儀（米歐mix-28+，廣州圍谷潤儀器有限公司）充分勻漿裂解，然后70 ℃水浴10 min，并離心收集管壁上的液滴，然后加入200 μL 聚苯乙烯緩沖液 和150 μL 吸收溶液，渦旋混勻20 s，靜置5 min后離心5 min，取上清液至2 mL離心管，加入等體積5′-二磷酸鳥苷二鈉緩沖液，混勻，獲得DNA柱。然后用1%瓊脂糖（Biowest Agarose，西班牙）凝膠電泳（DYY-6C，北京市六一儀器廠）檢測基因組DNA的完整性及是否發生蛋白等污染，DNA樣品于 -80 ℃ 保存待用。

1.3.2.2 目的基因擴增及Illumina測序 采用具有條形碼標記的引物341F：C C T A C G G G N G G T C W G C A G、806R：G G A C T A C H V G G G T A C T A A T對細菌16S rDNA 的V3-V4區進行MiSeq擴增子測序。第1輪擴增體系包括：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，25 mmol/L MgSO4 3.0 μL，引物341F（10 μmol/L） 1.5 μL，引物806 R （10 μmol/L） 1.5 μL，KOD酶 1.0 μL，模板X μL（100 ng），用蒸餾水定容至 50 μL。然后利用AMPure XP Beads 進行PCR純化，純化后用Qubit 3.0定量。進入第二輪擴增，擴增體系包括：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，25 mmol/L MgSO4 3.0 μL，索引引物（10 μmol/L）1 μL，PCR通用引物（10 μmol/L） 1 μL，KOD酶1 μL，模板 X μL（100 ng），再用蒸餾水定容至 50 μL。使用AMPure XP Beads 對第二輪擴增產物進行純化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies，美國）進行定量，根據Novaseq 6000的樣品要求規范化操作后，采用PE250模式上機測試。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2016進行數據處理，用IBM Statistics SPSS 19.0進行方差分析。利用軟件平臺Usearch（version 7.0）對相似度在97%條件下的操作分類單元（OUT）進行質控拼接和Tag聚類去嵌合體，獲得OTU的豐度和OTU代表序列，生成稀釋曲線，由圖1可知，各樣本的稀釋曲線基本趨于平坦，說明本次測序數據量合理，能夠比較真實地反映土壤樣本的細菌群落。利用軟件Mothur（version v.1.30.1）計算反映群落豐富度的Sobs指數、Chao1指數、Ace指數和反映群落多樣性的Shannon-Wiener指數、Simpson指數。然后利用R語言vegan包進行群落柱狀圖的統計和作圖，以及主坐標分析（principal coordinate analysis，簡稱PCoA）、非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，簡稱NMDS）、非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡稱UPGMA）分析，利用冗余分析（redundancy analysis，簡稱RDA）評價環境因子與細菌群落分布的關聯性。

2 結果與分析

2.1 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤的化學性質

由表1可知，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤樣本的有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量及pH值存在顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）差異。與CK相比，健株和病株根際土壤樣本的pH值隨連作年限增加極顯著（P<0.01）降低，有機質和堿解氮含量呈先升后降的趨勢，速效磷和速效鉀含量呈極顯著（P<0.01）增加的趨勢。與CK相比，HT2、HT4和HT8樣本的pH值分別下降0.8、0.9、2.5，ST2、ST4和ST8樣本的pH值分別下降0.8、0.7、2.1。除連作8年煙田健株和病株根際土壤樣本的有機質含量均低于CK外，其他處理顯著高于CK或與CK一致。總體看，連作2年和連作4年煙田健株和病株根際土壤樣本的土壤養分含量整體一致，而連作8年煙田健株和病株根際土壤樣本的土壤pH值和有機質、堿解氮含量整體較低。健株根際土壤pH值整體低于染病煙株，但速效磷含量均明顯高于染病煙株，短期連作（2～4年）煙田健株根際土壤樣本的速效鉀含量明顯低于病株，連作8年的煙田則以健株稍高。

2.2 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細菌群落組成分析

在門水平上，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤細菌優勢菌群相對豐度存在一定差異。由物種分布堆疊圖（圖2）和相對豐度值（表2）可以看出，變形菌門（Proteobactera）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）是不同連作年限煙田健株和病株根際土壤的6個優勢菌群，累積相對豐度總和為89.1%～93.9%。隨連作年限的延長，HT2、HT4和HT8樣本變形菌門和髕骨細菌門的相對豐度呈增加趨勢，且均大于CK，放線菌門、芽單胞菌門的相對豐度呈先降后升趨勢，浮霉菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、己科河菌門的相對豐度呈先升后降趨勢，綠彎菌門的相對豐度呈降低趨勢。ST2、ST4和ST8樣本的變形菌門、放線菌門、髕骨細菌門的相對豐度呈增加趨勢，浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和己科河菌門的相對豐度呈降低趨勢，僅疣微菌門的相對豐度呈先升后降趨勢。

2.3 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細菌群落的α多樣性分析

Sobs指數是細菌群落豐富度的實際觀測值，Ace指數和Chao1指數用于反映細菌群落豐富度，Shannon-Wiener指數用于反映群落多樣性。由表3可知，連作煙田健株和病株根際土壤細菌群落豐富度和多樣性存在差異。HT2、HT4和HT8樣本的Sobs指數、Chao1指數和Ace指數及Shannon-Wiener指數均表現為隨連作年限的增加呈先增后降的趨勢，說明隨連作年限的延長，連作煙田健株根際土壤細菌群落豐富度和多樣性先增后降，其中HT8樣本細菌群落豐富度和多樣性均明顯小于HT2和HT4樣本。ST2、ST4和ST8樣本的Sobs指數、Chao1指數和Ace指數及Shannon-Wiener指數均表現為隨連作年限的增加呈降低趨勢，說明隨連作年限的延長，煙田病株根際土壤細菌群落的豐富度和多樣性降低。健株和病株根際土壤樣本間物種覆蓋度均無顯著性差異，均大于0.99，說明樣本測序飽和度均較高。

2.4 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細菌群落的β多樣性分析

主成分分析（principal component analysis，簡稱PCA）和非度量多維尺度分析是基于OTU列表的物種豐度信息反映樣本間群落組成距離關系的方法。PCA用于研究樣本間的組成距離關系，NMDS分析可以更好地反映生態學數據的非線性結構，脅強系數（stress）越小（小于0.1較好），說明模型越可靠。從圖3-a可以看出，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）對樣品差異的貢獻值為82.18%，且PC1對樣品差異的貢獻值最高。NMDS分析結果（圖3-b）顯示，stress為0.050，小于0.1，說明模型可靠性高。圖3-a和圖3-b均表現出短期連作（2～4年）煙田的健株和病株樣本距離較近，群落組成較相似，而與CK、HT8和ST8樣本的距離較遠，說明群落結構差異較大。進一步進行Anosim檢驗，結果表明，相同連作年限煙田健株和病株樣本細菌群落組成無顯著差異，但均與CK樣本有顯著差異（P<0.05）。3種連作年限的煙田健株（HT2、HT4和HT8）樣本、病株（ST2、ST4和ST8）樣本與CK樣本之間，及HT2、HT4和HT8樣本之間，ST2、ST4和ST8樣本之間的細菌組成均有極顯著差異（P<0.01）。

2.5 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤理化性質對細菌群落的影響

為了解土壤理化因子對連作煙田健株和病株根際土壤微生物群落分布的影響，在屬水平上進行冗余分析。從圖4-a可以看出，在屬水平上，RDA的前2個軸總共解釋了95.60%的群落變化，第1個軸和第2個軸分別解釋了85.15%、10.45%的群落變化，說明觀察樣本聚類特征與分組一致。從圖 4-b 和表4可以看出，在門水平上，土壤pH值與變形菌門的相對豐度呈極顯著負相關關系（r=-0.505，P<0.01），與酸桿菌門（r=0.578，P<0.01）和綠彎菌門（r=0.581，P<0.01）的相對豐度呈極顯著正相關關系，與浮霉菌門（r=0.402，P<0.05）和裝甲菌門（r=0.429，P<0.05）的相對豐度呈顯著正相關關系，與藍藻細菌門的相對豐度呈顯著負相關關系（r=-0.417，P<0.05）;土壤有機質含量與擬桿菌門的相對豐度呈顯著正相關關系（r=0.379，P<0.05）;土壤堿解氮含量與細菌群落的相對豐度無顯著相關性;速效磷含量與酸桿菌門（r=-0.395，P<0.05）和綠彎菌門（r=-0.407，P<0.05）的相對豐度呈顯著負相關關系;土壤速效鉀含量僅與硝化螺旋菌門的相對豐度呈極顯著正相關關系（r=0.479，P<0.01）。從圖4-c可以看出，在屬水平上，根際土壤有機質、速效磷、速效鉀含量及pH值對細菌群落的分布影響以pH值的貢獻度（15.77%）最大，堿解氮和速效鉀含量的貢獻度為負值，表示對根際土壤細菌物種分布無意義。

3 討論與結論

本研究結果表明，連作煙田健株與感染根腐病煙株根際土壤細菌群落的相對豐度及多樣性存在差異。變形菌門、放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門為幾種連作煙田土壤健株和病株根際土壤的優勢菌群。研究表明，變形菌門是最為普遍的細菌門[22]，同時包含了大量的動植物致病菌[23]，其豐度的增加可能引起土壤環境抗逆性降低，植株發病率增加。本試驗中，隨連作年限的增加，變形菌門的相對豐度呈明顯增加的趨勢，且感染根腐病煙株根際土壤變形菌門的相對豐度明顯高于健株。試驗中，除了連作2、4年的健株和連作2年的病株放線菌菌門相對豐度較低外，其余樣本均較高，且表現出病株大于健株。說明隨連作年限的延長，土壤變形菌門逐漸演化成優勢菌群。絕大多數放線菌為腐生菌，但少數寄生性放線菌則能引起某些動植物的病害[24]，其含量的高低可作為土壤健康狀況的評價指標[25]。隨連作年限的增加，總體上連作煙田健株和病株根煙株根際土壤酸桿菌門、綠彎菌門的相對豐度呈明顯降低趨勢，且整體表現為病株下降幅度大于健株。有研究認為，土壤細菌是環境變化的敏感指標，其組成和多樣性與氣溫、降水以及土壤pH值、有機碳和全氮等含量密切相關[26]，土壤微生物群落結構差異可指示土壤環境的變化[27]。岳思君等研究認為，引起硒砂瓜連作障礙的發生主要因素是隨著連作時間的增加，放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、厚壁菌門等有益微生物豐度下降造成的[28]。該研究說明隨連作年限的延長，土壤細菌群落結構趨向性改變，土壤細菌性病原菌相對豐度可能增加，而細菌有益菌群落相對豐度降低。

有研究表明，土壤中微生物多樣性越高、結構越復雜，系統的穩定性也越高[29]。試驗中，烤煙短期連作（2～4年）煙田健株和病株根際土壤細菌群落豐度和多樣性較高，群落組成較為相近，與撂荒土壤（CK）的距離較遠，而連作8年煙田健株（ST8）和病株（ST8）根際土壤細菌群落相對豐度和多樣性均顯著減小。說明隨連作年限的延長，土壤微生態穩定性降低，進而影響土壤系統抗性。土傳病害的發生與土壤環境密切相關[30-31]，土壤微生物與植物健康的相互關系研究備受關注。土壤微生物尤其是根際微生物的組成、結構、多樣性和生態網絡關系與植物土傳病害的發生密切相關[32-35]。汪洋等綜述了農田管理措施對土壤微生物的影響，認為提高有機肥和磷肥的施用比例有利于土壤中微生物豐富度的提高和微生物量碳的積累[36]。納小凡等研究認為，因為土壤pH值是影響微生物群落結構組成最重要的因素之一[10]，本試驗中根際土壤pH值對健株和病株根際土壤細菌群落分布影響最大，說明pH值是影響細菌群落分布及豐富度的核心環境因子。本研究的供試土壤隨連作年限的延長，pH值明顯降低。因而針對連作植煙地塊，生產中可通過撒施生石灰，增施有機肥、生物質炭、過磷酸鈣等方式以提高連作土壤pH值，進而改善連作土壤微生態環境。

綜上所述，本研究利用Illumina高通量測序技術探明了連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細菌群落結構和多樣性的變化，為連作煙田烤煙根腐病的防治及土壤改良提供了借鑒。然而本研究只關注了連作煙田健株和病株根際細菌群落的豐富度、多樣性及其細菌群落與連作土壤理化因子的關聯性，未探明根腐病發病與相關細菌菌群的相關性，以及真菌群落豐富度、多樣性的變化情況，在今后的研究中將加以完善。

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