矩鐮莢苜蓿地下芽越冬期間超微結構適應性變化

楊小霞，方強恩，張勃，張金青

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

植物在低溫脅迫環境中，一些組織細胞的超微結構會有一定的變化［1］，這些變化主要集中于液泡、質體、脂滴、細胞壁、以及質膜等亞細胞結構。如，質體通常通過變形的方式分解淀粉來增加細胞質的可溶性糖濃度，從而增強植物的抗寒能力［2-3］。質膜的外吐作用將細胞質小泡（包括小液泡）中包含的大分子物質釋放到質膜外，參與細胞壁構建，增加細胞壁的堅固性，增強植物細胞的抗寒性，防止植物細胞因冰凍失水而造 成機械性損害［4-5］。杜艷等［6］對七葉樹（Aesculus chinensis）冬芽的研究表明，隨溫度的降低，其冬芽細胞內的液泡黑色致密物、膜泡和吞噬泡不斷增加，這些液泡內含物的增加有利于阻止冰晶的形成，可以提高越冬植物細胞的抗寒防凍能力，且細胞間發生質壁分離的現象。方強恩等［7］對紫花苜蓿（Medicago sativa）越冬芽的研究中表明，在自然越冬過程中，越冬芽幼葉細胞內的液泡由大體積液泡且透明逐漸被分割為小體積液泡，透明度也逐漸降低，質膜內陷，質體變為月牙形或馬蹄狀，質體內淀粉粒減少甚至消失，細胞之間發生質壁分離，細胞超微結構經過適應性調整，逐漸提高了越冬芽的抗寒能力。植物越冬芽細胞器與膜結構的穩定性是植物安全越冬的關鍵［8］。因此，植物超微結構的觀察和分析對揭示植物越冬芽越冬抗寒具有重要的科學意義。

矩鐮莢苜蓿（M.archiducis-nicolai），又稱青藏扁蓿豆，是豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）多年生野生優質牧草，分布于我國西部高寒地區［9］。研究表明，該植物的越冬芽對寒冷的環境具有極強的耐受性［10］。目前，關于矩鐮莢苜蓿的研究主要涉及地理分布、栽培技術［11］，營養價值的［12］、遺傳多樣性［10，13］等方面。但是，矩鐮莢苜蓿地下芽在低溫脅迫下超微結構的變化仍不清楚。因此，本試驗以矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉為材料，通過觀察其自然越冬過程中芽幼葉細胞超微結構的適應性變化，旨在解釋矩鐮莢苜蓿地下芽越冬抗寒的細胞學機制，以期為矩鐮莢苜蓿抗寒育種與寒地栽培技術研究提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究材料為矩鐮莢苜蓿（M.archiducis-nicolai）自然種群個體，采自青藏高原東緣天祝縣甘肅農業大學高山草原試驗站禁牧草場。

1.2 試驗方法

1.2.1矩鐮莢苜蓿地下芽的取樣方法試驗在2018年8月-2019年2月進行。根據當地氣溫（圖1）的變化，將矩鐮莢苜蓿地下芽分4個時期取樣4次。1）生長期（SS）：最低氣溫在5 ℃以上，平均氣溫不低于10 ℃，取樣日期為2018年7月15日；2）秋末冷適應期（CA）：最低氣溫在0 ℃以上，平均氣溫不低于5 ℃，取樣日期為2018年9月24日；3）初冬冷脅迫期（ES）：從最低氣溫降到0 ℃以下開始，到平均氣溫降到0 ℃前，取樣日期為2018年10月26日；4）隆冬凍脅迫期（FS）：從平均氣溫降到0 ℃以下開始，到回升至5 ℃之前，取樣日期為2018年12月11日；根據氣溫的變化，每次在試驗地采集矩鐮莢苜蓿生長健康、長勢一致的地下芽8-10個，迅速清洗干凈，以備切塊固定。

1.2.2透射電鏡芽幼葉切片的制備預冷及固定：將矩鐮莢苜蓿地下芽快速清洗干凈，放在預冷處理的載玻片上，用鋒利刀片從芽端幼葉頂部切取0.1 cm×0.2 cm的小塊，置于青霉素小瓶中，加入預冷的固定液（0.1 mol/L、pH值=7.0的磷酸緩沖液）中，室溫下固定2 h。

脫水：室溫下用漂洗液漂洗3次，每次漂洗15 min，再用1%四氧化鋨固定2 h。吸出四氧化鋨，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH值=7.0）漂洗1 h，其中中間進行4次換液，隨后在50%，70%，80%，90%，95%，100%乙醇（2次）溶液中逐級進行常溫脫水，每次20 min，EPON812環氧樹脂浸透、包埋、聚合。

切片和染色：用（EMUC6）萊卡超薄切片機切片，厚度為70 nm。最后將超薄切片撈于載物網上，經醋酸雙氧鈾（30 min）和檸檬酸鉛（10 min）進行雙重染色。

觀察：樣品放于電鏡下（JEM-1230，日本）進行觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 矩鐮莢苜蓿在生長期芽幼葉細胞超微結構

矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內液泡大，細胞核位于細胞壁附近，核仁清晰可見。細胞核外面有少數質體（圖2-A，B，C），質體內含少量淀粉（圖2-C），多數質體為圓形和橢圓形（圖2-A，B，C），少數為變形蟲狀（圖2-D）。細胞壁薄，胞間連絲數量多且清晰可見（圖2-F）。質膜光滑，細胞未發生質壁分離的現象。少數液泡在吞噬一些脂內物質和細胞器（圖2-E，F，白色箭頭），多數液泡體積增大。

圖2 矩鐮莢苜蓿地下芽生長期幼葉細胞超微結構Fig.2 Ultrastructural changes of young leaf cells of Medicago archiducis-nicolai in underground budding stage

2.2 矩鐮莢苜蓿在秋末冷適應期芽幼葉細胞超微結構

矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內大多數液泡還未開始溶解，部分液泡開始溶解為小液泡（圖3-D）。細胞核開始向細胞中央移動，核膜周緣有少量異染色體，核仁清晰。質體內含大量淀粉，且有許多質體圍繞在細胞核周圍，質體被膜完整，多為卵圓形狀和橢圓形狀（圖3-A）。胞間連絲的數量多，細胞壁薄。質膜依然光滑，細胞未發生質壁分離的現象。細胞內有脂滴出現（圖3-A，B，E）。

圖3 矩鐮莢苜蓿地下芽秋未冷適應期幼葉細胞超微結構Fig.3 Ultrastructural changes of young leaf cells of underground buds in Medicago archiducis-nicolai in late autumn cold adaptation

2.3 矩鐮莢苜蓿在初冬冷脅迫期芽幼葉細胞的微結構

矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內的大體積液泡基本已經溶解為小體積液泡，且液泡正在內吞細胞器和脂內物質（圖4A-F）。細胞核向細胞中央移動，核仁較清晰（圖4-A）。質體變形為馬蹄狀和變形蟲狀（圖4-B），內含有少量淀粉。芽幼葉細胞內質膜內陷呈波狀，發生質壁分離現象（圖4-C），胞間連絲開始變得模糊（圖4-F），細胞壁較厚。細胞內有脂滴出現（圖4-A）。

圖4 矩鐮莢苜蓿地下芽冷脅迫期幼葉細胞超微結構Fig.4 Ultrastructural changes of young leaf cells in early winter cold stress stage of underground buds of Medicago archiducis-nicolai

2.4 矩鐮莢苜蓿在隆冬凍脅迫期芽幼葉細胞超微結構

溫度在0～-20 ℃，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內的大液泡基本均溶解為小體積液泡，小體積液泡數量較多（圖5A-F）。細胞核幾乎都移動到細胞的正中央，部分細胞核仁消失（圖5-B），細胞核中有少量異染色體出現（圖5-A，B，C）。矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內有大量脂滴出現（圖5-C，D）。質體內含有少量淀粉。細胞發生質壁分離，使得胞間連絲被阻斷而變得模糊且數量也減少，細胞壁增厚（圖5-F）。

圖5 矩鐮莢苜蓿地下芽隆冬脅迫期幼葉細胞超微結構Fig.5 Ultrastructural changes of young leaf cells of Medicago archiducis-nicolai underground buds during the early stage of winter freezing stress

3 討論

3.1 矩鐮莢苜蓿越冬芽幼葉細胞超微結構對秋冬低溫的適應

植物細胞中的水分主要來自液泡，低溫環境下，液泡通過減小體積，增大其內密度來減少內部水分，以此來抵御低溫環境，一旦液泡結冰受凍將會使整個植物受凍害［14］。本研究發現，自然越冬過程中，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內的液泡初始較大且內部透明，隨后被分割為小體積的液泡，并且逐步吞入脂內物質和各種細胞器。這與前人對其他植物的研究結果相類似，如韓善華等［15］對冬季沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）葉肉細胞、楊鳳仙等［5］對棉花（Gossypiumspp.）葉肉細胞的研究均發現，低溫環境條件下，植物葉肉細胞內液泡小且含有一些膜狀結構的物質，液泡的體積也變小，研究表明，植物細胞在低溫環境下，液泡中會出現多膜狀結構或小泡，液泡逐漸被分割為小液泡。這種變化可以防止細胞結冰，從而使植物適應低溫環境［5，8］。

質體是有機體細胞中的一種原質體，具有多種形態，會因為外界環境的影響而發生變形，多變為變形蟲狀、啞鈴形狀、馬蹄形狀等［3］。在自然低溫環境中，質體中的淀粉粒隨日均氣溫的降低而減少，起初聚集在細胞核的周圍，后期幾乎消失，推測分解淀粉粒是質體變形的原因之一［2］。淀粉粒通過不斷分解為可溶性糖，增加細胞質濃度，以此適應低溫環境［16］。本研究發現，矩鐮莢苜蓿芽幼葉細胞內的質體在越冬過程中，質體由圓形或橢圓形變形為馬蹄形、變形蟲狀，其質體內的淀粉粒也逐漸減少。這與前人的研究結果相似，如陳旭微［6］對蠶豆（Vicia faa）下胚軸的研究發現，低溫脅迫下，蠶豆下胚軸細胞內質體中淀粉粒數量顯著下降，且部分質體的形態由圓形變為啞鈴型。這表明矩鐮莢苜蓿地下芽可能通過分解淀粉粒使質體發生變形來適應冬季寒冷的環境。有研究發現，當質體不再以分裂的方式增加數目時，質體的形狀多為圓形或橢圓形［17］。本研究中，凍脅迫期，部分質體的形狀為圓形，這可能是因為矩鐮莢苜蓿芽幼葉在該時期處于休眠狀態，因而質體停止分裂，數目不再增加，不再分解淀粉，形狀也不再發生變化。

脂滴是一種分布廣泛、進化高度保守的細胞器，由磷脂單分子層、中性脂核和大量脂滴以及相關蛋白組成［18］。研究發現，脂滴的出現與活性氧的清除有關，是在低溫環境下類囊體降解產物的聚集［19］。本研究發現，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內均有脂滴的出現，在隆冬凍脅迫期出現的脂滴最多。王麗雪等［20］和劉艷［21］等的研究也表明，隨著低溫的加劇，葡萄（Vitis vinifera）和梨（Pyrusspp.）枝條細胞出現了大量的脂滴。已有研究表明，植物在低溫脅迫下出現大量脂滴可能是為了適應其低溫的環境［22-23］。本研究中，隨著日均氣溫的逐漸降低，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞內出現了大量的脂滴，這可能是該植物對低溫環境的一種積極的適應性行為。

3.2 矩鐮莢苜蓿越冬芽越冬期抗寒性的變化

上述分析表明，秋末冷適應期低溫環境中，越冬芽細胞內的液泡、質體、細胞核與脂滴的數量與功能經過積極的適應性變化，逐步增強了矩鐮莢苜蓿的抗寒性。到初冬冷脅迫期和隆冬凍脅迫期，隨著氣溫的逐漸降低，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞發生了質壁分離現象，致使胞間連絲的數量減少且逐漸變得模糊（圖4-3，圖5-6）。大量研究表明，低溫脅迫下，植物會發生質壁分離的現象，使得胞間連絲發生阻斷或斷連，從而產生共質體分區，使植物體的整體連絲網絡被破壞，體內的物質運輸和信息傳遞受阻，甚至完全中斷，使植物的生長減弱甚至停止，植物體進入暫時性的休眠，從而提高植物體對逆境的抗性［24］。據此分析，通過前期的低溫鍛煉，到嚴冬時期矩鐮莢苜蓿越冬芽細胞內的生理活動已經減弱至極低點，并通過進入休眠狀態來適應寒冷的冬季。

4 結論

自然越冬過程中，矩鐮莢苜蓿地下芽幼葉細胞的各種細胞器的結構與功能發生了相應的變化。隨低溫的加劇，芽幼葉細胞內質體變形，質體內淀粉粒不斷降解，大體積液泡幾乎消失，小液泡不斷的內吞脂內物質和各種細胞器。脂滴細胞器數量不斷增加，細胞發生質壁分離，胞間連絲逐漸變模糊甚至發生斷連。該植物地下芽通過細胞器結構的變化，使得自身進入休眠狀態，進而抵御寒冷脅迫，安全越冬。