煙嘧磺隆降解菌Chryseobacterium sp. LAM-M5的分離、鑒定及其降解機理研究

馬青云 江旭 李情情 宋金龍 周義清 阮志勇，4，5

（1. 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所/CAAS-CIAT可持續農業聯合實驗室，北京100081；2. 中國農業科學院研究生院，北京100081；3. 中國水產科學研究院，北京 100141；4. 西藏農牧學院資源與環境學院，林芝 860000；5. 煙臺大學生命科學學院，煙臺 264005）

化學除草劑在保障糧食產量和質量方面發揮了重要的支撐作用。然而，中國作為除草劑生產和使用大國，每公頃農田中除草劑的平均使用量為世界平均水平的 1.5-4 倍［1］，除草劑殘留正成為限制中國現代農業綠色發展的瓶頸問題之一［2］。磺酰脲類除草劑屬于高效、低毒、高選擇性的新型除草劑，被廣泛應用于水稻、玉米、小麥、大豆等田間雜草的防控，其用量也逐年遞增［3］。2015 年全世界磺酰脲類除草劑的銷售額已達20.19億美元，占整個除草劑市場的11.0%［4］。煙嘧磺隆是磺酰脲類除草劑的代表性品種（圖1），年銷售額達2.82億美元［5］，由于其淋溶性較強，易對土壤及地下水造成污染，對生態環境和人類健康存在潛在的威脅［6-8］，同時影響輪作和后茬敏感作物，并危害水生生態系統的穩定。

圖1 煙嘧磺隆化學結構式［3］Fig.1 Chemical structural formula of nicosulfuron

煙嘧磺隆在自然環境中可通過化學水解［9］、微生物代謝［10］和光催化實現降解［11］。微生物代謝降解是實現煙嘧磺隆從環境中去除的最主要過程，也是最有效和環境友好的途徑。迄今為止，已經從農田土壤、工廠排污口、河流、活性污泥等多個生態系統中分離出了多個煙嘧磺隆降解菌株。Zhao 等［12］從磺酰脲類除草劑污染的農田土壤中分離得到的糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）ZWS11，在6 d內對初始質量濃度為 500 mg/L的煙嘧磺隆的降解率達 80% 以上。代鵬飛等［13］從農藥廠的活性污泥中分離到一株能以煙嘧磺隆為唯一碳源生長的假單胞菌（Pseudomonas）YN-8，在7 d內對100 mg/L 的煙嘧磺隆降解率為65.4%。張國民等［14］從玉米田土壤中分離到一株紅假單胞菌（Rhodopseudomonas），在7 d內對400 mg/L的煙嘧磺隆降解率為32.3%。Wang等［15］從人工濕地土壤中分離得到的克雷伯氏菌（Klebsiella）Y1，在 6 d內對100 mg/L的煙嘧磺隆降解率為78.90%。Carles等［16］從煙嘧磺隆污染的農田土壤中分離到一株（Pseudomonas fluorescens）SG-1，在1 d內對2.5 mg/L的煙嘧磺隆降解率為77.5%。此外，研究人員還分離到了具有煙嘧磺隆降解能力的真菌，例如，Feng等［17］從活性污泥中分離到一株青霉菌（Penicillium）YC-WC1，在6 d內能完全降解100 mg/L的煙嘧磺隆。許多研究人員從降解菌株中發現了多種降解相關的功能基因及酶，例如，李順鵬等［18］從嗜甲基菌（Methylophilussp.）S113 菌株中獲得了噻吩磺隆水解酶基因tsmE，該基因的表達產物在1 h 內能夠將100 mg/L 的噻吩磺隆完全水解。Ruan等［19］對庫特氏屬（Kurthia huakuii）LAM0713菌株克隆得到一個新的酯酶基因sue，該基因的表達產物在 15 min 內對50 mg/L的醚磺隆降解率達43.2%。宋金龍［20］從黃籃狀菌（Talaromyces flavus）LZMl中純化得到的黃素單加氧酶fmo，在15 min內對50 mg/L煙嘧磺隆的降解率達 71.7%。

目前已報道的煙嘧磺隆降解菌的多樣性十分有限，僅集中在芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）等幾個屬中，難以滿足不同環境條件下煙嘧磺隆污染的生物修復需求，因此，有必要從不同環境樣品中分離得到更多更豐富的煙嘧磺隆降解菌資源，并進行功能評價及降解機理研究。本研究從合肥某煙嘧磺隆生產廠的活性污泥中分離并篩選得到一株能以煙嘧磺隆為唯一氮源生長菌株，對其進行分類鑒定和降解機理研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 供試樣品采自安徽合肥某磺酰脲類除草劑生產廠廢水處理池的活性污泥，采集后裝入滅菌自封袋中帶回實驗室，用于煙嘧磺隆降解菌的分離。

1.1.2 主要試劑 煙嘧磺隆（分析純，＞ 95%）購自上海阿拉丁有限公司，Taq DNA 聚合酶（MT201）、dNTPs、DNA Marker、所用引物購自博邁德有限公司，乙腈（色譜純）等有機試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 培養基 GSM培養基：5.0 g葡萄糖，0.2 g NaCl，0.1 g CaCl2，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·12H2O，pH 7.0，無 機 鹽 培 養 基：1.0 g Na3HPO4·12H2O，0.5 g K2HPO4，0.2 g MgSO4·12H2O，pH 7.0。在115℃條件下高壓滅菌20 min。牛肉膏蛋白胨固體培養基：3.0 g牛肉膏，10.0 g蛋白胨，5.0 g NaCl，20.0 g瓊脂，1 000 mL水，pH 7.4-7.6，121℃條件下高壓滅菌20 min，液體培養基中不加瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 煙嘧磺隆降解菌的富集與篩選 取10 g污泥樣品添加到100 mL含終濃度為50 mg/L的煙嘧磺隆的無機鹽培養基中，于30℃、160 r/mim的搖床上避光培養30 d，然后以5%的接種比例將該體系轉接至100 mL含150 mg/L煙嘧磺隆的新鮮無機鹽培養基中，每次提高煙嘧磺隆濃度50 mg/L，并使煙嘧磺隆終濃度達到200 mg/L。馴化3個月后將培養液用無菌水進行倍比稀釋后涂布到含50 mg/L煙嘧磺隆的無機鹽固體培養基上。將出現的菌落劃線純化后放置- 80℃冰箱保藏備用。

1.2.2 煙嘧磺隆降解菌的初步鑒定 將獲得菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，30℃恒溫培養 2 d后觀察菌落形態，采用革蘭氏染色法確定菌株革蘭氏類型。將菌株接種于牛肉膏液體培養基中并置于30℃，160 r/mim的搖床上培養過夜，利用DNA提取試劑盒提取菌液DNA，經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，以該DNA為模板進行PCR擴增。利用細菌通用引物1492R和27F擴增該菌株中的16S rRNA基因［21］，純化的PCR產物由北京博邁德測序公司進行測序。PCR反應體系為（25 μL）：模板DNA 1 μL；正向及反向引物各 1 μL；Taq PCR Mix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL。PCR 程序如下：95℃，初始變性 5 min；95℃，變性 30 s；55℃退火 30 s；72℃延伸 1.5 min，循環 30 次；72℃，延伸 10 min。將測序結果提交至EzBioCloud［22］進行序列比對，根據比對結果，選擇相似性高的菌株作為參比并下載相關模式菌株的16S rRNA基因序列，通過 CLUSTAL X［23］進行多序列比對，使用MEGA7.0［24］構建系統發育樹確定該菌的分類地位。

1.2.3 菌株降解性能測定 將菌株LAM-M5接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30℃，165 r/min的恒溫搖床上避光培養48 h。將培養液在8 000 r/min的轉速下離心5 min，棄上清，收集菌體。用0.13mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.2）洗滌菌體3次后重懸，以5.0%（V∶V）接種比例接入含終濃度50 mg/L煙嘧磺隆的GSM培養基中，于30℃、165 r/min條件下避光培養，研究降解菌對煙嘧磺隆的降解效果，以未接種的相同體系作為空白對照，所有實驗均重復3次，定期取樣檢測液體培養基中煙嘧磺隆殘留量。

煙嘧磺隆的測定采用高效液相色譜法［25］，根據標準物質的保留時間定性、標準物質的峰面積外標法定量。本實驗采用Agilent 1200 LC高效液相色譜：色譜柱：Dikam Diam onsil C18，柱長 250 mm×4.6 mm，內徑5 μm；柱溫：30℃；流速1.0 mL/min；流動相：乙腈∶水∶冰乙酸 =（30∶70∶0.05，V∶V∶V）；進樣量10 μL，檢測波長245 nm。根據公式計算降解能力：降解率/% =［1 -（實測殘量/對照樣實測殘量）］× 100%［26］。

1.2.4 菌株降解煙嘧磺隆的特性研究 菌株的降解特性研究包括菌株在不同溫度、pH及接種量條件下對煙嘧磺隆的降解能力。設置不同溫度（15、20、25、30和35℃），不 同pH值（5、6、7、8和9）和不同接種量（0.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，V∶V），將菌株接種至不同條件下含煙嘧磺隆GSM培養基中作為處理組，以相同條件下不接入菌株為對照組，測定煙嘧磺隆殘余濃度計算菌株的降解率。

1.2.5 短鏈有機酸的鑒定 利用HPLC檢測并鑒定菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM培養基中產生的短鏈有機酸情況，檢測條件：流動相為磷酸二氫銨（0.02 mmol/L，pH 2.7）與甲醇的混合物（比例為85∶15，V∶V），進樣量為10 μL，光電二極管陣列檢測器的波長為210 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30℃。以分析純級的草酸、L -蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸和富馬酸作為參照標樣。

1.2.6 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆中間產物的檢測 將菌株LAM-M5按1.2.3的方法培養并制備OD600為1.0的菌懸液。取5.0%的LAM-M5菌懸液接種到含有50 mg/L煙嘧磺隆的GSM培養基，以相同條件但不接菌的GSM培養基作為空白對照，分別培養3 d后取樣，上述所有實驗均設3次重復。使用配備電噴霧電離的Xevo三重四極桿（Xevo-TQD）質譜儀（Waters Corp，Milford，MA，USA）進行檢測。質量模式m/z為100-450［27］，Masslynx NTV的正模式（ESI +）和負模式（ESI -）的ESI源被用于收集和分析獲得的數據［28］。

1.2.7 菌株LAM-M5全基因組測序及分析 將菌株LAM-M5送至諾禾致源科技有限公司（北京，中國）進行基因組測序，具體流程參考文獻［29］。菌株全基因組測序完成后，分析菌株的基因組成分，分析預測編碼基因、非編碼 RNA、重復序列、CRISPR 等基因組成分，并使用KEGG、GO、Swissprot、NR、COG等數據庫對編碼基因序列進行功能注釋。結合已報道降解相關的基因，搜索并分析該菌株中可能存在的與煙嘧磺隆降解相關的功能基因信息。

2 結果

2.1 煙嘧磺隆降解菌株的分離

將富集培養得到的富集液進行煙嘧磺隆的降解驗證，發現富集液對煙嘧磺隆幾乎無降解作用，接下來對富集液進行平板稀釋涂布，共獲得18株細菌，其中菌株LAM-M5的降解能力最強，在GSM培養基中7 d（30℃，5%接種量）對50 mg/L的煙嘧磺隆的降解率可達92.39%，選作后續研究菌株。

2.2 煙嘧磺隆降解菌株的鑒定

菌株LAM-M5在牛肉膏蛋白胨固體培養基上培養48 h后，菌落呈金黃色，不透明（圖2）。革蘭氏陰性，無鞭毛。

圖2 菌株LAM-M5在牛肉膏蛋白胨培養基平板上的菌落形態Fig.2 Colony morphology of strain LAM-M5 on the beef extract peptone medium plate

將菌株LAM-M5的16S rRNA基因序列（1 505 bp）提交至Genbank數據庫中（序列登錄號為：MW647553）。將該基因序列信息在EzBiocloud網站上進行比對，結果表明，LAM-M5的16S rRNA基因序列與Chryseobacterium lacusYLOS41T相似性最高，達到99.93%。利用 NJ（neighbor joining method）法構建系統發育樹（圖3）可以看出，菌株LAM-M5與來自Chryseobacterium屬的菌株聚在一起，因此，初步將該菌株鑒定為Chryseobacteriumsp. LAM-M5。自NCBI數據庫中下載菌株Chryseobacterium lacusYLOS41T的全基因組信息，通過OrthoANIu algorithm（https://www.ezbiocloud.net/tools/ani）分析菌株間的平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）。結果表明，菌株LAM-M5的基因組序列與Chryseobacterium lacusYLOS41T的ANI值是97.74%，利 用Genome-to-Genome Distance Calculator 2.1（http://ggdc.dsmz.de/）計算菌株間的DNA雜交同源性（DNA-DNA hybridization，DDH），菌株LAM-M5與Chryseobacterium lacusYLOS41T間的DDH值為79%，兩個數值均高于定義同種的閾值（ANI 95%-96%和DDH 70%）［30］，因此將該菌株LAM-M5鑒定為Chryseobacterium lacus，這是首次關于金黃桿菌屬（Chryseobacterium）菌株降解煙嘧磺隆的報道。

圖3 基于16S rRNA基因序列構建的NJ系統發育樹Fig.3 Neighbour-joining phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequences

2.3 煙嘧磺隆的降解特性

LAM-M5可以在較寬的pH值范圍（5-9）內降解煙嘧磺隆（圖4-A），降解率隨pH值的降低而增加。初始pH值為6.0時，菌株LAM-M5對煙嘧磺隆的降解效果最佳，可達92.39%。在第3天時，開始對50 mg/L煙嘧磺隆表現出明顯的降解，此時體系pH值開始下降；第7天時，體系pH值降至3.5，此時菌株LAM-M5對50 mg/L的煙嘧磺隆降解率達到92.39%。菌株LAM-M5對溫度具有較好的適應性，它在15℃-35℃范圍內均能降解煙嘧磺隆，且降解效率隨溫度增加而增加（圖4-B），在35℃時降解效果最佳，達到98.39%。菌株LAM-M5的初始接種量對煙嘧磺隆的降解率也有影響，隨著接種量的增加，降解效率有明顯的增加，初始接種量為10% 時，降解效率最高，達到99.6%。

圖4 不同pH值（A）、溫度（B）、接種量（C）對菌株LAM-M5 降解煙嘧磺隆降解率的影響Fig.4 Effects of different pH（A），temperature（B）and initial inoculum ratio（C）on the degradation of nicosulfuron by strain LAM-M5

同時驗證了菌株LAM-M5對其他田間常用除草劑的降解，例如，磺酰脲類除草劑氯嘧磺隆和三酮類除草劑硝磺草酮，在相同的培養條件和降解體系內，菌株LAM-M5對這兩類除草劑在7 d內均無降解。

2.4 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆過程中產生的短鏈有機酸的鑒定

本研究中，菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM培養基中培養時，體系pH值在7 d之內從7.0降至3.0左右（圖5）。利用HPLC對菌株的培養液進行了檢測，在培養液中檢測到了大量L -蘋果酸，由于煙嘧磺隆在酸性條件下極不穩定，推測菌株LAM-M5通過代謝葡萄糖產生大量L-蘋果酸，降低環境pH值，從而使煙嘧磺隆發生脲橋斷裂而降解。

圖5 LAM-M5降解煙嘧磺隆過程中pH值的變化Fig.5 Change of pH value during the nicosulfuron degradation by strain LAM-M5

2.5 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆代謝產物的檢測及其代謝途徑的推測

通過高效液相色譜與質譜聯用［31］，對菌株LAM-M5在含煙嘧磺隆的GSM液體培養基中培養3 d后的中間代謝產物進行檢測與分析。ESI源檢測結果表明，在陰離子和陽離子模式下，共檢測到5個片段，質荷比分別為409m/z，259m/z，228m/z，156m/z，304m/z。根據已報道的代謝途徑及中間產物的化學結構［31-33］，對檢測片段的物質類型和產生途徑進行了推斷，其中陰離子模式中的259.44m/z（2-（N-氨基甲酰磺酰磺酰基）- N，N-二甲基丙酰胺）是由于磺酰脲橋C-N鍵的斷裂產生，并進一步斷裂酰胺鍵產生228.38m/z（2-氨基磺酰基-N，N-二甲基丙酰胺）。陽離子模式下質荷比為304.18m/z（N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）甲磺酰胺）的產生是由于煙嘧磺隆中吡啶環的開環［34］；在陽離子模式下檢測到的155.41m/z（2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶）產物是由304.18m/z產物的磺酰脲橋的酰胺鍵斷裂產生。綜上，推測得出了菌株LAM-M5在GSM培養基中對煙嘧磺隆可能的降解途徑（圖6）。

圖6 菌株LAM-M5降解煙嘧磺隆的代謝途徑Fig .6 Proposed metabolic pathways of nicosulfuron degradation by strain LAM-M5

2.6 菌株LAM-M5基因組分析

2.6.1 菌株LAM-M5基因組測序數據分析 通過對菌株LAM-M5的基因、重復序列、非編碼 RNA 等的預測，獲得了該菌株基因組的組成基本情況信息（表1）。菌株LAM-M5的基因總長度為5.704 Mb，基因組中含基因數量達6 366個，平均長度 896 bp。串聯重復序列共 280個，總長為 17 086 bp，占基因組全長的 0.2707%。小衛星序列 211個，微衛星序列 0個，tRNA 121個，rRNA 14個。

表1 LAM-M5的基因組組分結果統計Table 1 Genomic characteristics of strain LAM-M5

2.6.2 菌株LAM-M5對煙嘧磺隆降解酶基因的預測 在該研究中，對菌株LAM-M5進行基因組Swiss-port的數據庫分析，同時結合已報道的煙嘧磺隆的降解基因分析，對菌株LAM-M5中可能參與煙嘧磺隆降解的相關基因進行了預測，結果如表2所示。

表2 菌株LAM-M5 基因組中7個降解酶相關的基因Table 2 7 genes related to degradation enzymes in the genome of strain LAM-M5

3 討論

煙嘧磺隆長期使用造成的殘留會對土壤及地下水造成污染，對生態環境和人類健康存在潛在的威脅，同時損害后茬敏感農作物，并危害水生生態系統的穩定性。因此尋找高效、環境友好、經濟的除草劑污染環境治理方法十分迫切。微生物修復技術無毒、無殘留，避免了二次污染，是消除煙嘧磺隆殘留及保障農產品安全的有效途徑之一。目前已經從各種環境樣本中通過富集馴化等方式獲得了許多煙嘧磺隆的降解資源。但是這些降解資源僅限于環境中的優勢屬，例如芽孢桿菌屬（Bacillus），假單胞菌屬（Pseudomonas）等。環境中存在著豐富的微生物資源，許多具有降解功能的菌株資源未被發掘，可嘗試通過培養組學［35］的方法獲得更多的煙嘧磺隆降解的菌株資源，豐富除草劑的微生物降解資源庫。本實驗從某煙嘧磺隆生產廠的活性污泥中，分離出一株煙嘧磺隆高效降解菌株LAM-M5，通過16S rRNA的基因序列比對，初步將菌株鑒定為Chryseobacterium lacusLAM-M5。

在已報道的煙嘧磺隆微生物降解途徑與相關機制中，煙嘧磺隆主要通過脲橋上的C-N鍵斷裂完成降解。Zhao等［12］在糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalisZWS11）對煙嘧磺隆的降解產物中檢測到了N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶，并由此推斷這兩個降解產物是由磺酰脲橋的C-N鍵斷裂直接得到的。Zhang等［36］根據粘質沙雷氏菌（Serratia marcescensN80）對煙嘧磺隆的主要降解產物推測了其降解途徑，其中化合物N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶均是在微生物作用下直接從煙嘧磺隆獲得，分別來自于磺酰脲橋上 C-N 鍵的斷裂。現有的研究發現，不同種類微生物對煙嘧磺隆的降解途徑均存在差異，并導致所產生的中間降解產物有所不同［37］，但是幾乎所有的煙嘧磺隆降解體系中都能直接檢測到產物N，N-二甲基-2-氨基磺酰基-3-吡啶甲酰胺和2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶，表明這兩種化合物是在微生物作用下直接由煙嘧磺隆產生的。但是在本研究中，檢測到的2-氨基-4，6-二甲氧基嘧啶并不能在菌株LAM-M5的作用下直接獲得，而是由中間產物N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）酰胺鍵斷裂后生成的。表明菌株LAM-M5對煙嘧磺隆的降解過程和機制不同于糞產堿桿菌和粘質沙雷氏菌。

在以前的報道中，對黃籃狀真菌（Talaromyces flavusLZM1）［21］和臘狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）［32］降解煙嘧磺隆的代謝產物進行了比較深入的研究。這兩個菌在降解煙嘧磺隆過程中均能直接產生259.44 m/z（2-氨基磺酰基-N，N-二甲基煙酰胺），304.18 m/z（N-（4，6-二甲氧基嘧啶-2-基氨基甲酰基）-1-（甲基亞氨基）甲磺酰胺）和另外一個346m/z（2-（1-（4，6-二甲氧基-嘧啶-2-）-脲基）-N，N-二甲基-煙酰胺）產物，說明這兩個菌均能通過3種途徑降解煙嘧磺隆。而在本研究中，雖然我們嘗試不同時間取樣和改變檢測條件，但是346 m/z這個產物卻始終檢測不到，說明菌株LAM-M5對煙嘧磺隆的降解過程和機制不同于黃籃狀真菌和臘狀芽孢桿菌。

同時監測到該菌株與煙嘧磺隆共培養過程中，體系的pH值從7.0減少到3.0，環境酸化，而煙嘧磺隆在酸性條件下極不穩定，從而造成煙嘧磺隆的脲橋發生斷裂，推測這可能是一種微生物自我保護機制。通過對菌株的全基因組信息分析，發現該菌株的基因序列中含有大量已報道的參與煙嘧磺隆降解過程的功能基因，如水解酶［19］、氧化酶［37］、酯酶［38］、過氧化氫酶［39］等。

4 結論

從活性污泥中獲得了一株煙嘧磺隆的高效降解菌，初步鑒定為Chryseobacterium lacusLAM-M5，該菌最適的降解條件為35℃，pH 6.0，接種量10%時菌株對50 mg/L的煙嘧磺隆降解率最高可達 92.39%。菌株在以葡萄糖為碳源時，通過產生大量的L-蘋果酸導致體系內pH值下降，造成煙嘧磺隆脲橋斷裂。菌株Chryseobacterium lacusLAM-M5對煙嘧磺隆具有較高的降解能力。