一株產木聚糖酶的蠟樣芽孢桿菌對雪茄煙葉成分及發酵產物的影響

李志豪 張鴿 貊志杰 鄧帥軍 李佳軼 張海波 劉曉暉劉好寶1，

（1. 青島農業大學農學院，青島 266109；2. 中國農業科學院煙草研究所 煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；3. 中國科學院青島生物能源與過程研究所 生物能源研究室，青島 266101；4. 深圳煙草工業有限責任公司，深圳 518000）

雪茄外包皮煙葉是一支雪茄的精華部分，優質的雪茄外包皮煙葉要求葉片較薄、葉脈較細、韌性較強、顏色均勻有光澤［1］，其中葉脈粗細是衡量雪茄外包皮煙葉品質優劣的重要指標。近些年我國國產雪茄煙的銷量逐年升高，但我國上等雪茄煙葉嚴重匱乏，尤其是優質雪茄外包皮煙葉絕大部分依賴于進口［2］。國產雪茄煙葉存在組織致密，柔韌性差，支脈粗大，燃燒性差，香氣水平不足等問題，提高國產雪茄外包皮煙葉品質能極大降低我國雪茄煙生產成本［3］。雪茄外包皮煙葉作為高價值產品，支脈較粗會嚴重影響雪茄外包皮煙葉的外觀進而影響銷售價格；且葉脈和葉肉結構組成有差異，雪茄外包皮煙葉中葉脈含量較高會導致煙葉燃燒不均勻。因此，降低雪茄外包皮煙葉的葉脈含量，改善雪茄外包皮煙葉的品質，成為雪茄外包皮煙葉研究的熱點。

研究表明，煙葉中細胞壁物質含量對雪茄外包皮煙葉物理性狀影響較大［4］。煙葉的纖維素、半纖維素含量與煙葉等級有一定相關性，纖維素與半纖維素含量一般隨等級增高而降低［5］。也有研究指出：纖維素、半纖維素等含量較高，致使低等級煙葉刺激性較強、青雜氣重、吸味辛辣、澀口，并使煙葉的香氣不能顯露［6］。且相對于葉片，葉脈中木質素、纖維素、半纖維素等細胞壁物質含量較高［7］，通過常規的物理化學方法較難去除［8］。目前對木質纖維素降解的研究多集中在菌株利用及降解的方式，且研究熱點主要集中在纖維素和木質素降解菌的篩選及研究中［9］，對半纖維素降解菌的研究較少［10］。葉脈細胞中含有相對較多的半纖維素，且木聚糖是半纖維素中含量最豐富的聚合物，可以通過木聚糖酶對其進行降解［11］。利用微生物對雪茄外包皮煙葉進行發酵，是定向提升雪茄外包皮煙葉品質的重要途徑。

芽孢桿菌屬（Bacillus）是目前雪茄煙葉發酵過程中的主要菌屬［12］，也是主要的木聚糖酶產生菌之一。它能夠通過分泌木聚糖酶使大分子化合物半纖維素等降解為小分子物質［13］。木聚糖酶被廣泛應用于紡織、造紙、食品、飼料等行業［14］，目前利用木聚糖酶改善雪茄外包皮煙葉品質的研究鮮有涉及。鑒于此，本研究利用前期篩選的一株蠟樣芽孢桿菌，對菌株的煙堿耐受性做了檢測，隨后利用液態發酵實驗確定菌株利用雪茄煙葉產木聚糖酶的最佳發酵條件，并在最佳條件下測定菌株對煙葉中半纖維素的降解效果，最后分析比較了菌株對煙葉香氣物質成分的影響。本研究期望能改善雪茄煙葉品質，為利用微生物及酶等生物技術手段改善雪茄煙葉品質提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 雪茄外包皮煙葉上分離的蠟樣胞桿菌Bacillus cereusL-1（GenBank收錄號：MW570877），保藏于中國科學院青島生物能源與過程研究所系統微生物工程實驗室，該菌株經培養能產生木聚糖酶，可用于雪茄外包皮煙葉的發酵。

1.1.2 煙葉 實驗煙葉在取自于中國煙草總公司海南省局海口雪茄所屯昌縣雪茄發酵基地的D1品種中部葉，保存在中國科學院青島生物能源與過程研究所系統微生物工程實驗室，-20℃冰箱內。1.1.3 培養基 煙葉發酵培養基：K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母粉 5.0 g，雪茄外包皮煙葉粉末 20.0 g，加水定容至1 L，115℃滅菌30 min。LB培養基：10.0 g胰蛋白胨，10.0 g NaCl，5.0 g酵母粉，加入去離子水定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 隨機抽取部分樣品，除去煙葉主脈，將煙葉放入不高于40℃±2℃的烘箱中烘至恒重。從烘箱中取出烘好的樣品粉碎，過40目篩，充分搖動，混勻。此即為制備好的試樣。

1.2.2 菌株對煙堿耐受性檢測 測定該菌株對尼古丁的耐受性，將菌株置于含有尼古丁的液體LB培養基中，在含有50 mL培養基的250 mL搖瓶中，按照3%（V/V）接種量進行接種，培養基中尼古丁的濃度分別為0、0.5、1.0、2.0 g/L，以0 g/L為對照，37℃，180 r/min培養，每間隔2 h檢測培養液在600 nm處的吸光度值，通過菌株生長狀況反應菌株對尼古丁的耐受情況。每個實驗處理進行3次重復。

1.2.3 煙葉培養基發酵條件優化 研究菌株利用煙葉發酵產木聚糖酶的最佳發酵條件為后期菌株在雪茄煙葉發酵中的應用具有重要的參考價值。確定菌株利用雪茄煙葉發酵的最適發酵周期，為后期發酵做指導。將保藏的菌株接入LB液體試管培養基中活化，搖床培養6-8 h獲得種子液，然后轉接至含100mL液體LB培養基的250 mL錐形瓶中，37℃，180 r/min 振蕩培養8 h獲得二級種子液，然后轉接于含100 mL煙葉發酵培養基的250 mL 錐形瓶中，接種量5%（V/V），底物濃度15 g/L。發酵培養，每隔6 h 進行取樣，直到培養48 h。按照何敏超［15］的方法測得木聚糖酶酶活，繪制產酶曲線。每組設3個平行試驗。

培養基初始pH對菌株產木聚糖酶的影響：利用氯化氫和氫氧化鈉溶液分別調整培養基中的初始pH值為5、6、7、8，以及自然pH，115℃滅菌30 min。將菌株置于37℃，200 r/min培養24 h，接種量5%。每次試驗3個重復。

不同的接種量對菌株產木聚糖酶的影響：在最佳煙葉粉末濃度以及最佳初始pH條件下，將二級種子液轉接至發酵培養基中，接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%。將菌株置于37℃，200 r/min培養24 h。每次試驗3個重復。

培養基中最適底物濃度確定：設定培養基中雪茄煙葉粉末分別為5，10，15，20，25 g/L，測定菌株產木聚糖酶的情況。將菌株置于37℃、200 r/min培養24 h，接種量5%。每次試驗3個重復。

1.2.4 雪茄煙葉木質纖維素含量的測量 以無菌液接種作為空白對照（CK），原始煙葉粉末作為初始對照，將培養獲得的樣品分別轉移至500 mL 離心杯中，并以5 000 r/min離心20 min。取沉淀，在40℃烘箱中持續烘干直至恒重。烘干后的樣品以及對照按照采用美國國家可再生能源實驗室（NREL）的檢測方法［16］檢測木質素，纖維素，半纖維素含量，并進行分析。

1.2.5 發酵產物檢測 將制得的樣品以及對照，按照文獻中的方法［17］進行發酵產物的檢測。定性采用NIST08.L 標準譜庫檢索。

2 結果

2.1 菌株對煙堿耐受性

在本研究中，我們探索了菌株在含有500-2 000 mg/L的尼古丁的培養基中的生長情況（圖1）。結果顯示，培養基中煙堿含量在1.0 g/L及以下時，菌株生長與對照相比無較大差異，其生長基本不受該濃度下煙堿的抑制，該含量大于煙葉中尼古丁的含量；當培養基中尼古丁含量為2.0 g/L時，菌株的生長受到嚴重抑制。

圖1 菌株對煙堿的耐受性結果Fig. 1 Tolerance of the strain to nicotine

2.2 菌株發酵產酶周期曲線

以D1煙葉粉末為碳源，對蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusL-1進行液態發酵，測定發酵液中的木聚糖酶酶活，以了解其在發酵體系中酶活的動態變化過程。其木聚糖酶酶活變化曲線如圖2所示，6-12 h木聚糖酶酶活緩慢增大，12-18 h酶活速率加快，在24 h時酶活效率達到最大，24 h之后酶活速率緩慢下降。該結果指導后期酶活測定發酵周期可以控制在24 h，以便獲得較大的酶活。

圖2 菌株發酵產酶曲線Fig. 2 Curve of enzyme production by the fermentation of the strain

培養基中初始pH對菌株利用雪茄煙葉產木聚糖酶的影響如圖3所示，在自然pH時（6.7），酶活效率最高；當pH過大或過小時，菌株產木聚糖酶的活性都呈現下降趨勢。由圖4 可知，當接種量小于5%時，隨接種量的增大，酶活效率在增加；接種量為5%時，酶活效率最高達到（3.81±0.61）U/mL；過度增加接種量，酶活減小，可能是菌株之間營養物質競爭增加。培養基中雪茄煙葉粉末是菌株發酵中重要的碳源，其濃度對菌株產木聚糖酶的影響結果如圖5所示。培養基中底物濃度為20 g/L濃度時，木聚糖酶活性可達（4.04±0.18）U/mL，明顯高于其余處理；但過大提高培養基中煙葉粉末的濃度，木聚糖酶活性不再增加。

圖3 初始培養基pH對菌株產酶的影響Fig. 3 Influence of initial medium pH on the enzyme production of the strain

圖4 接種量對菌株產酶的影響Fig. 4 Influence of inoculation amount on the enzyme production of the strain

圖5 培養基中煙葉濃度對菌株產酶的影響Fig. 5 Influence of cigar leaves concentration in medium on the enzyme production of the strain

2.3 煙葉木質纖維素含量變化

蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusL-1在以初始pH 6.7、5%接種量、底物濃度20 g/L的條件下發酵24h，雪茄外包皮煙葉中的木質纖維素成分含量及變化結果如圖6所示。由圖6可知，由菌發酵處理的煙葉粉末與不加菌液的對照相比，半纖維素的含量由3.62%降為3.38%，減少了6.63%；纖維素含量則有更明顯的減少，由11.48%降為10.54%，減少了8.19%。木質素含量在菌處理和對照以及原始煙葉成分中含量差異性不顯著。該結果表明菌株不僅在雪茄煙葉的半纖維素降解中發揮作用，而且對纖維素降解也具有較明顯的效果。

圖6 菌株發酵對雪茄煙葉中木質纖維素成分的影響Fig. 6 Effects of strain fermentation on the lignocellulose content in cigar leaves

2.4 煙葉發酵產物變化

雪茄外包皮煙葉中致香物質種類繁多，對煙葉的香型、香氣質、香氣量有不同的影響。經GC/MS定性分析，共檢測出87種化合物。經與譜庫檢索及分析，主要的物質有肉豆蔻醛、棕櫚酸、法尼基丙酮、葉綠醇、油酸、正二十六烷、正二十七烷、正三十一烷等。相較于原始煙葉，菌處理煙葉肉豆蔻醛和法尼基丙酮含量有所減少，葉綠醇含量增加，油酸含量增加。廣泛存在于烤煙煙葉、白肋煙煙葉、香料煙煙葉以及煙氣中的正二十六烷和正三十一烷均有所增加，正二十七烷含量減少。菌處理與對照相比，棕櫚酸的含量減少較多，葉綠醇和油酸含量均增加。正二十六烷、正二十七烷和正三十一烷對照組和原始煙葉含量相差較小。因此可知菌處理可明顯提升雪茄煙葉中葉綠醇、油酸、正二十六烷和正三十一烷（表1）。

表1 煙葉發酵產物含量變化Table 1 Changes in contents of the fermentation products in cigar leaves

3 討論

尼古丁具有細胞毒性，對多數微生物具有抑制作用［18］。探索菌株對尼古丁的耐受情況，為后期菌株在煙葉發酵中的應用提供基礎［19］。煙草葉片中尼古丁的平均含量達22 000 mg/kg左右［20］，在發酵培養基中相當于880 mg/L。在本研究中，測定1 000 mg/L尼古丁含量與無煙堿對照組相比菌株生長不受影響，該菌株在后期煙葉發酵中能發揮作用。

研究表明煙葉纖維素及半纖維含量過高，煙葉組織則粗糙且易碎，同時燃燒后產生的煙氣粗糙，易產生令人不愉快的氣味［21］。因此，在一定范圍內減少纖維素和半纖維素的含量，有助于提升雪茄外包皮煙葉品質。目前煙葉發酵中，針對纖維素的降解主要集中在烤煙等的研究中，如王煒等［22］篩選一株降解纖維素菌株，作用于煙葉時，可使煙葉纖維素最高降解率為8.94%；楊宗燦等［9］針對降解纖維素篩選到一株枯草芽孢桿菌，降解率可達30.6%。關于雪茄煙葉中半纖維素降解菌的篩選及利用目前鮮有報道，本研究篩選的菌株不僅在半纖維素降解中發揮一定作用，同時還可以降低煙葉中的纖維素含量，對后期煙葉發酵中含碳物質的降解發揮一定作用，期望后期能用于改善雪茄外包皮煙葉的韌性，進一步改善外包皮煙葉燃燒性，提升外包皮煙葉品質。后期如果復配其他菌劑用于雪茄外包皮煙葉的葉脈發酵處理中，期望能更好改善葉脈較粗的情況。

肉豆蔻醛具有脂肪香、牛奶香、奶油香、果香等，常用于日用香精中。葉綠醇和葉綠素在煙葉調制過程中可降解為新植二烯，新植二烯是一種重要的致香物質［23］。油酸是煙草中常見的一種高級脂肪酸［24］。烷烴是煙葉表面蠟質的主要成分，煙草中含量較多的烷烴多集中在二十五碳至三十五碳之間，占煙葉烷烴總質量的95%［25］。Oliveira等［26］發現植物表面正構烷烴是非常好的減弱水損失的屏障，也有研究［27］指出加入烷烴類化合物對煙絲有較為明顯的保潤效果。因此推測烷烴含量的提高可能對提升雪茄外包皮煙葉的保潤作用具有一定效果。李寧等［28］研究也證明芽孢桿菌在雪茄煙葉發酵過程中明顯改善煙葉勁頭、明顯降低刺激性、減少雜氣、提升香氣，提高煙葉的整體品質。

本研究中的蠟樣芽胞桿菌對雪茄煙葉中半纖維素及纖維素降解具有一定作用，后期可應用于雪茄外包皮煙葉的固態發酵研究，對改善雪茄外包皮煙葉物理特性提供理論指導，有望在雪茄煙葉發酵提質增香中發揮作用。

4 結論

本研究以蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusL-1發酵雪茄煙葉，確定了B. cereusL-1降解雪茄煙葉的最適發酵條件：在初始pH 6.7，5%接種量，20 g/L的底物濃度下發酵24 h，最高酶活可達（4.04±0.18）U/mL。在該發酵條件下，雪茄煙葉中半纖維素含量為3.38%，降低了6.63%，纖維素含量為10.54%，降低了8.19%，同時降低了煙葉中纖維素和半纖維素的含量；對發酵產物分析比較發現，香氣物質葉綠醇、油酸、正二十六烷和正三十一烷有較大提升。