牡丹根腐病原菌拮抗細菌抑菌活性物質(zhì)分析

楊瑞先 劉萍 王祖華 阮寶碩 汪智達

（洛陽理工學(xué)院環(huán)境工程與化學(xué)學(xué)院，河南 洛陽 471023）

牡丹根腐病又稱爛根病，是牡丹種植中的重要土傳病害。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病在牡丹多個種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，如在菏澤和洛陽主要觀賞區(qū)，根腐病的發(fā)病率一般在20%左右，嚴(yán)重地塊可達到40%以上［1］。該病主要為害牡丹根部，植株感病后，支根和須根變黑腐爛，并逐漸向主根擴展，造成地上部分長勢衰弱，葉片失綠、發(fā)黃，發(fā)病嚴(yán)重時整株常因無法吸收水分和養(yǎng)分導(dǎo)致植株萎蔫直至枯死［2］。目前，研究認(rèn)為引起牡丹根腐病的病原菌主要為腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），但尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）等在根腐病的發(fā)生和發(fā)展過程中，通常與腐皮鐮刀菌（F. solani）混合侵染，導(dǎo)致牡丹根腐病的發(fā)生機制較為復(fù)雜［3-4］。

目前，在生產(chǎn)過程中主要采用農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)防治的方法控制牡丹根腐病的發(fā)生［5-6］，雖取得了一定效果，但未從根本上解決根腐病的防治難題。牡丹根腐病防治過程中主要存在兩個困難：一是牡丹為多年生植物，若采用輪作和換土的方法，在實際生產(chǎn)中難以實施，且成本較大；二是化學(xué)防治的效果不理想，且易造成病原菌抗性增加和土壤中農(nóng)藥殘留，因此，急需探索根腐病防治的新途徑。生物防治作為一種安全有效的防治方法日益受到重視，尤其是利用選育的內(nèi)生拮抗菌株對植物病害進行防治，可從根本上抑制病原菌生長繁殖，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，控制植物連作條件下土傳根腐病病害的發(fā)生，且能夠有效避免化學(xué)農(nóng)藥帶來的防治缺點。

近年來，研究者采用4種商用生防菌劑MC -1（枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis制劑）、B130-1（巨大芽胞桿菌B. megaterium制劑）、BA31和 BXN（枯草芽胞桿菌B. subtilis制劑）進行牡丹根腐病的防治，結(jié)果表明菌劑BA31和 BXN對牡丹根腐病的防治效果較好，其防效可達80%以上［7］。王雪山等［8］從牡丹根際土壤中分離獲得了7株對牡丹根腐病原菌具有平板拮抗作用的細菌菌株，其抑菌帶寬度在2-5 mm之間，為牡丹根腐病的生物防治提供了一些微生物資源。孟國慶等［9］從多年生牡丹發(fā)病植株根際土壤中獲得了兩株對牡丹根腐病原菌具有抑菌作用的菌株，經(jīng)鑒定均為芽孢桿菌屬（Bacillus）細菌。這些微生物在牡丹根腐病的生物防治中表現(xiàn)出了很好的應(yīng)用潛力。

為進一步拓展牡丹根腐病的生防菌資源，本研究從健康牡丹根部組織中進行內(nèi)生細菌的分離，通過前期篩選獲得了2株對牡丹根腐病菌具有拮抗作用的細菌，并將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，進一步探討2個菌株抑菌活性物質(zhì)的組成，并解析在抑菌作用過程中發(fā)揮主要生防作用的次生代謝產(chǎn)物，以期為牡丹根腐病的生物防治提供新的微生物資源，并為將來2個菌株在牡丹根腐病防治中的實際應(yīng)用提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌：牡丹根腐病原菌（F. solani）由本課題組2019年4-5月間從洛陽牡丹國花園根腐病發(fā)病植株上分離、鑒定并保存的致病能力強的菌株。

1.1.2 供試內(nèi)生細菌：解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）md8和md9由本課題組 2019年9-10月間分離自洛陽理工學(xué)院牡丹種植地健康牡丹根部組織。

1.1.3 供試培養(yǎng)基：內(nèi)生細菌純化采用 TSA 培養(yǎng)基（胰蛋白胨3 g，植物蛋白胨1 g，氯化鈉1 g，瓊脂15 g，定容至1 L，pH7.2）；根腐病原菌的純化及平板抑菌作用采用PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1 L，自然pH）；拮抗菌株脂肽類物質(zhì)的提取采用Landy 培養(yǎng)基［10］。

1.2 方法

1.2.1 拮抗牡丹根腐病原菌內(nèi)生細菌菌株的鑒定 根據(jù)菌落形態(tài)特征和16S rDNA基因序列鑒定具有拮抗作用的內(nèi)生細菌菌株md8和md9，具體方法參考文獻［11］。

1.2.2 菌株md8和md9脂肽類化合物合成基因PCR 檢測分析 以菌株md8和md9的基因組DNA為模板，通過PCR 擴增Fengycin 合成基因fenA，Surfactin 合成基因srfAA，Iturin 合成基因ituD，分別參考Koumoutsi和Hsieh文獻合成基因引物［12-13］，引物序列詳見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，擴增程序為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min、55℃退火1min、72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測菌株md8和md9 基因組中相關(guān)脂肽類化合物合成基因的擴增情況。PCR產(chǎn)物切膠回收后，連接到載體pMD18-T 上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆測序。測序由上海生工生物工程股份有限公司完成，DNA測序后的產(chǎn)物序列利用NCBI 數(shù)據(jù)庫的Blast 程序進行同源檢索，與GenBank 數(shù)據(jù)進行比對分析。

表1 脂肽類物質(zhì)合成基因片段引物序列Table 1 Primer sequence for lipopeptide biosynthesis genes fragments

1.2.3 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)的提取、凝膠層析分離及抑菌活性測定

1.2.3.1 脂肽類物質(zhì)的提取及凝膠層析分離 采用酸沉淀和甲醇抽提法提取菌株md8和md9的脂肽類粗提物，具體方法參考文獻［10］。將菌株md8和md9產(chǎn)生的脂肽類粗提物配制成合適濃度，利用Sephadex LH-20凝膠柱（1.6 cm×80 cm）進行分離純化，上樣體積2 mL，洗脫溶劑為甲醇，流速為1 mL/min，紫外檢測波長為220 nm，每5 min收集1管，合并相關(guān)主要洗脫峰，用真空冷凍干燥機進行減壓蒸干，磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH=7.0）溶解備用。

1.2.3.2 脂肽類物質(zhì)及凝膠層析分離組分抑菌活性測定 采用牛津杯對峙培養(yǎng)法測定菌株md8和md9脂肽類粗提物及凝膠層析分離組分對牡丹根腐病原菌的抑菌活性。具體方法為：取直徑5 mm根腐病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基平板中央，將牛津杯插至距培養(yǎng)皿邊緣1.5 cm處，將150 μL過濾除菌的脂肽類粗提物及凝膠層析分離組分分別加入牛津杯中，每個處理重復(fù)3 次，對照只接種病原菌，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d后，測量抑菌帶的寬度。

1.2.4 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR分析

1.2.4.1 菌體收集 采用平板對峙法準(zhǔn)備用于熒光定量PCR分析的細菌樣品。具體方法為：在平板一側(cè)劃線接種拮抗細菌菌株，另一側(cè)接種直徑5 mm根腐病原菌菌餅，28℃倒置培養(yǎng)。分別收集對峙培養(yǎng)2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d的細菌菌體5 mg，以平板僅接種拮抗菌株的細菌菌體為對照，所有收集菌體均置于1.5 mL離心管中-80℃冷凍備用。每 10個平板作為1個生物學(xué)重復(fù)，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。共采集 14 組樣品，分別包括菌株md8和md9 與根腐病原菌對峙培養(yǎng)后2 d、3 d、4 d、5 d、6 d和7 d的細菌樣品12組，以及在PDA平板上僅接種細菌菌株md8和md9，培養(yǎng)2 d后收集的菌體樣品2組。

1.2.4.2 菌體RNA的提取、質(zhì)量檢測及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) 按照OMEGA E.Z.N.A?Bacterial RNA Kit（Omega Bio-Tek公司）試劑盒說明書的使用方法提取細菌樣品RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計在260/280 nm處測定各樣品RNA的濃度和純度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser Kit（TaKaRa公司）試劑盒說明書的使用方法將細菌樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4.3 熒光定量PCR檢測 根據(jù)DNA 測序獲得的拮抗菌株脂肽類物質(zhì)合成基因序列，設(shè)計熒光定量PCR引物，序列詳見表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成。以細菌rpsJ基因（編碼細菌核糖體蛋白）作為內(nèi)參基因［14］，利用ABI7500實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，USA）對樣品進行定量檢測。熒光定量PCR的反應(yīng)體系為：2×SYRBR Green Buffer 10 μL；引物（10 μmol /L）0.5 μL；cDNA模板 2μL；ddH2O 6.4 μL，總體積為20 μL。PCR的反應(yīng)程序為：95℃ 預(yù)變性30 s，95℃ 變性5 s，60℃ 退火30 s，循環(huán)40 次。實時熒光定量結(jié)果Cq值采用 2-△△Ct方法進行相對定量［15］。

表2 脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR引物序列Table 2 Primer sequences for lipopeptide biosynthesis genes in RT-qPCR

1.2.5 基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜鑒定抑菌物質(zhì) 利用基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析菌株md8和md9凝膠層析分離組分中具有抑菌活性的物質(zhì)成分結(jié)構(gòu)。MALDITOF-MS 具體方法參照文獻［16］，使用337 nm 氮激光源解吸附和電離，采用α-氰-4-羥肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）為基質(zhì)，將具有抑菌作用的分離組份置于儀器離子源進行測定，質(zhì)量掃描范圍為100 - 2 000 Da。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19 和Excel 2010 軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌株md8和md9的鑒定

經(jīng)前期篩選，菌株md8和md9對牡丹根腐病原菌具有顯著的抑菌作用。利用形態(tài)學(xué)特征和分子生物學(xué)方法進行菌株鑒定。形態(tài)結(jié)果表明菌株md8和md9的菌落均為白色，圓形，干燥，邊緣不規(guī)則，環(huán)狀凸起，革蘭氏染色均為陽性，菌體均為桿狀（圖1）。菌株md8和md9的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物長度分別為1 446 bp和1 438 bp，其在 GenBank中的登錄號分別為MT233097和MT233098，利用NCBI中的BLAST軟件進行比對分析，結(jié)果表明菌株md8和md9與解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）序列相似度高達99%，選取與其序列相似性較高的模式菌株，通過MEGA 7.0軟件中的鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株md8和md9與解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）聚在同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rRNA基因分子生物學(xué)鑒定，將菌株md8和md9鑒定為解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）。

圖1 拮抗菌株md8和md9菌落和菌體形態(tài)特征（10×100）Fig.1 Colonies and morphological characteristics of antagonistic strain md8 and md9（10×100）

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的拮抗細菌md8和md9的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of antagonistic strain md8 and md9 based on 16 S rDNA sequences

2.2 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因分析

利用3對引物對拮抗菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因進行PCR擴增，結(jié)果表明拮抗菌株md8和md9均能夠擴增獲得ituD、fenA和srfkAA基因片段，其片段大小分別約為1 300 bp、1 500 bp和1 500 bp（圖3）。將擴增獲得的特異條帶回收純化，克隆測序，分別獲得菌株md8和md9的3個脂肽類物質(zhì)合成基因片段序列。Blastn 比對結(jié)果表明，菌株md8的合成基因組中ituD基因片段（1 312bp）與B. amyloliquefaciensUMAF6639（CP006058）序列同源性達到99%，fenA基因片段（1 559 bp）與B.amyloliquefaciensB15（CP014783）同源性達到99%，srfAA基因片段（1 632 bp）與B. amyloliquefaciensMBE1283（CP013727）同源性達到98%；菌株md9的合成基因組中ituD基因片段（1 328 bp）與B. amyloliquefacienssubsp.plantarumCAUB946（HE617159）序列同源性達到99%，fenA基因片段（1 555 bp） 與B. amyloliquefaciensY2（CP003332）同源性達到99%，srfAA基因片段（1 640 bp）與B.amyloliquefaciensLFB112（CP006952）同源性達到99%。利用 Blastx 將獲得的基因片段序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中非冗余蛋白質(zhì)序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株md8和md9的fenA、srfAA、ituD基因片段序列分別與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）非核糖體物質(zhì)芬薺素合成酶蛋白序列、表面活性素合成酶蛋白序列、伊枯草菌素類桿菌霉素D合成酶蛋白序列相似性達到99%，說明利用特異引物所擴增獲得的基因片段為相應(yīng)的非核糖體物質(zhì)類脂肽類物質(zhì)合成基因序列，表明菌株 md8和md9具有合成脂肽類抑菌物質(zhì)的能力。

圖3 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因片段PCR擴增電泳結(jié)果Fig. 3 Electrophoresis of PCR amplified lipopeptide biosynthesis gene fragments of strain md8 and md9

2.3 菌株md8和md9脂肽類物質(zhì)合成基因熒光定量PCR分析

平板對峙實驗結(jié)果表明，不同培養(yǎng)時間菌株md8和md9對牡丹根腐病原菌的抑菌作用有所變化，對峙培養(yǎng)后的5-7 d抑菌作用相對穩(wěn)定（圖4）。利用RNA提取試劑盒提取處理樣品和對照樣品的RNA，結(jié)果顯示所有樣品RNA提取質(zhì)量較好，OD260/280均在 1.9-2.1 之間，能夠有效滿足后續(xù)試驗要求。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所有細菌樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，同時利用引物進行實時熒光定量 PCR。結(jié)果表明菌株md8和md9的ituD、fenA和srfAA合成基因在與牡丹根腐病原菌的對峙培養(yǎng)過程中其相對表達量發(fā)生了不同程度的變化（圖5和6）。與對照表達量相比，菌株md8芬薺素（fenA）和伊枯草菌素（ituD）合成基因在對峙培養(yǎng)6 d時相對表達量達到高峰，分別是對照的3.8倍和6.1倍，表面活性素合成基因（srfAA）的表達量在整個對峙培養(yǎng)過程中相對穩(wěn)定，僅為對照的2-3倍。菌株md9fenA和ituD合成基因表達量在對峙培養(yǎng)5 d時達到高峰，分別是對照的4.6倍和7.8倍，srfAA的表達量在整個對峙培養(yǎng)過程中相對穩(wěn)定，也僅為對照的2-3倍。熒光定量PCR結(jié)果表明，菌株md8和md9ituD合成基因在與根腐病原菌的對峙培養(yǎng)過程中被誘導(dǎo)表達，其表達量顯著高于對照基因的表達量，推測菌株md8和md9合成的伊枯草菌素類物質(zhì)可能在牡丹根腐病原菌平板抑制過程中發(fā)揮主要抑菌作用，同時fenA合成基因也被誘導(dǎo)表達，表明芬薺素類物質(zhì)對牡丹根腐病原菌也具有一定的抑制作用。

圖4 菌株md8和md9對牡丹根腐原菌的平板抑制作用（平板對峙培養(yǎng)6 d）Fig.4 Inhibitory effect of strain md8 and md9 inhibiting F. solani on the plate（plate confrontation cultured 6 d）

圖5 菌株md8脂肽類物質(zhì)合成基因在抑制牡丹根腐病原菌時的相對表達量Fig.5 Relative expressions of the lipopeptide biosynthesis genes of strain md8 inhibiting F. solani on the plate

2.4 菌株md8和md9脂肽類粗提物及凝膠層析組分的抑菌活性

菌株md8和md9脂肽類粗提物對牡丹根腐病原菌具有明顯的平板抑制作用，其抑菌帶寬度均可達到10 mm（圖7-A）。兩個菌株的脂肽類粗提物利用Sephadex LH-20凝膠層析柱層析分離，結(jié)合時間和220 nm處的吸光度收集分離組分，菌株md8共收集到10個分離組分，分別命名為A1-A10，菌株md9共收集12個分離組分，分別命名為B1-B12。牛津杯對峙培養(yǎng)法測定不同收集組分的抑菌活性，結(jié)果表明，菌株md8 層析分離組分A4和A5對牡丹根腐病原菌具有明顯的抑菌作用，其抑菌帶寬度分別為5.2 mm和3.1 mm（圖7-B），菌株md9 的3個分離組分B2、B3和B4對牡丹根腐病原菌具有不同程度的抑菌作用，其抑菌帶寬度分別為1.3 mm、6.2 mm和5.4 mm（圖7-C），其中組份B3對牡丹根腐病原菌的抑菌效果最為顯著，推測其為菌株md9抑制根腐病原菌的主要活性物質(zhì)。

圖7 菌株md8和md9脂肽類粗提物和凝膠層析分離組分對牡丹根腐病原菌的平板抑制作用Fig.7 Inhibition effect of lipopeptide extract and separation components via gel chromatography of strain md8 and md9 inhibiting F. solani

2.5 菌株md8和md9具抑菌活性分離組分的MALDI-TOF-MS分析

為進一步明晰菌株md8和md9對根腐病原菌具有抑菌作用的凝膠層析分離組分的物質(zhì)種類，利用 MALDI-TOF-MS分析具有抑菌活性的凝膠層析分離組分。菌株md8凝膠層析組分A4和A5 MALDITOF-MS分析結(jié)果表明（圖8），其中組分A4質(zhì)子化峰值m/z=1 031和1 045，其中1 031和1 045差一個亞甲基（-CH2），推測這種化合物為脂肪酸鏈相差一個亞甲基（-CH2）的同系物，與C14-C15的Bacillomycins D［M+H］+加 合 峰 相 對 應(yīng)，同時在組分A4中含有m/z=1 081的離子峰，與C16 Bacillomycins D的［M+Na］+加合峰相吻合，由已知文獻確定，菌株md8的組分A4主要為C14 Bacillomycins D［17］。組份A5的質(zhì)譜顯示在m/z=1 058、1 072和1 086處出現(xiàn)3個離子峰，其中1 058和1 072差一個亞甲基（-CH2），1 072和10 86之間差一個亞甲基（-CH2），表明它們?yōu)橥滴铮c屬于C15-C17 的Iturin B［M+H］+加合峰相對應(yīng)，同時在組分A5中含有m/z=1 096的離子峰，其響應(yīng)量相對較弱，與C15 Iturin B［M+K］+加合峰相吻合，由已知文獻確定，菌株md8的組分A5主要為C15 Iturin B［17］。菌株md9對根腐病原菌具有抑制作用的3個組分B2、B3和B4經(jīng) MALDI-TOF-MS分析（圖9），組分B2的質(zhì)譜顯示在m/z=1 519和1 533處出現(xiàn)離子峰，對應(yīng)于C20-C21 Fengycin A［M+H］+加合峰，由已知文獻確定，組分B2的主要物質(zhì)為Fengycin A［18］；組分B3的質(zhì)譜顯示在m/z=1 072和1 086出現(xiàn)二個離子峰，對應(yīng)于C15 Iturin B的質(zhì)核比，同時在B3組分中含有m/z=1 083的離子峰，其響應(yīng)量也相對較強，與C15 Bacillomycins D的［M+K］+加合峰相吻合，表明B3組分中可能含有C15 Iturin B和C15 Bacillomycins D兩種物質(zhì)；組分B4的質(zhì)譜顯示在m/z=1 058和1 086處出現(xiàn)2個離子峰，推測菌株md9組分B4的主要物質(zhì)種類為C15 Iturin B。

圖8 菌株md8凝膠層析分離組分A4（A）和A5（B）的MALDI-TOF-MS分析Fig.8 MALDI-TOF-MS analysis of separation component A4（A）and A5（B）produced by the strain md8

圖9 菌株md9凝膠層析組分B2（A）、B3（B）和B4（C）的MALDI-TOF-MS分析Fig.9 MALDI-TOF-MS analysis of separation component B2（A），B3（B）and B4（C）produced by the strain md9

3 討論

牡丹根腐病是嚴(yán)重影響牡丹栽培管理的一種土傳病害，其發(fā)病機制復(fù)雜，病原菌難以清除，目前尚無有效的防治方法。本研究對內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）md8和md9抑制牡丹根腐病原菌的活性物質(zhì)成分進行了分析，結(jié)果表明菌株md8和md9合成的伊枯草菌素類物質(zhì)為抑制牡丹根腐病原菌菌絲生長的主要活性物質(zhì)。目前研究表明，解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）產(chǎn)生的脂肽類化合物是其發(fā)揮生防作用的主要抗菌物質(zhì)，主要包含表面活性素（surfactins）、伊枯草素（iturins）和芬薺素（fengycins）三大類群［19-20］。其中伊枯草菌素（iturins）分子量約為1 000 Da，家族成員包括Iturins A、B、C、D，桿菌霉素Bacillomycins D、F、L等，Bacillomycin D 是Iturin家族的一類抗菌脂肽，它與Iturin 結(jié)構(gòu)相似，其氨基酸組成不同［21］。芬薺素（fengycins）分子量約為1 500 Da，家族成員主要包括Fengycins A和B，伊枯草菌素和芬薺素均具有強烈抑制真菌生長的能力，尤其對絲狀真菌抑制作用更加明顯［22］。桑建偉等［16］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌（B. amyloliquefaciens）BEB17對香蕉枯萎病菌（F. oxysporumf.sp.cubense）起主要抑制作用的物質(zhì)為芬薺素和伊枯草菌素；向亞萍等［23］研究發(fā)現(xiàn)桿菌霉素和芬薺素在菌株B1619 抑制番茄枯萎病菌（F. oxysporumf.sp.lycopersici）中起到相當(dāng)重要的作用；楊洋［24］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽胞桿菌（B.amyloliquefaciens）FZB42產(chǎn)出的桿菌霉素D和芬薺素是抑制禾谷鐮孢菌（F. graminearum）生長的主要活性物質(zhì)，尤其是桿菌霉素D的抑菌效果最為顯著。牡丹根腐病原菌屬于鐮刀菌屬（Fusarium）真菌，與香蕉枯萎病菌、番茄枯萎病菌和禾谷鐮孢菌為同屬病原菌，本研究表明菌株md8和md9抑制根腐病原菌生長的主要抑菌活性物質(zhì)為Iturin B、Bacillomycin D和Fengycins A，其中Iturin B和Bacillomycin D抑菌作用較為顯著，F(xiàn)engycins A抑菌作用相對較弱，表明伊枯草菌素類物質(zhì)在牡丹根腐病原菌生長過程中發(fā)揮主要的抑制作用，這與前人的研究結(jié)果是一致的。后期可進行菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化，進一步純化獲取 Iturin B和Bacillomycin D物質(zhì)，以為牡丹根腐病原菌的防治提供良好的生防菌劑。

圖6 菌株md9脂肽類物質(zhì)合成基因在抑制牡丹根腐病原菌時的相對表達量Fig.6 Relative expressions of the lipopeptide biosynthesis genes of strain md9 inhibiting F. solani on the plate

解淀粉芽胞桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽化合物結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，通過PCR擴增技術(shù)可對抗菌物質(zhì)的編碼調(diào)控基因進行檢測，從而初步判斷菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力和種類［25-26］。本研究PCR檢測結(jié)果表明菌株md8和md9含有3種脂肽類物質(zhì)的合成基因，MALDI-TOF-MS分析結(jié)果表明兩個菌株的抑菌活性物質(zhì)中確實含有脂肽類物質(zhì)，表明PCR檢測技術(shù)可以快速識別、篩選抗菌脂肽的產(chǎn)生菌，同時也可初步判斷菌株產(chǎn)生脂肽類物質(zhì)的種類，也再次證實基因檢測方法在抗菌脂肽產(chǎn)生菌鑒定方面具有較強的可行性。本研究中同時獲得了菌株md8和md9對根腐病原菌具有顯著抑制作用的物質(zhì)Iturin B，但由于前期未設(shè)計檢測Iturin B的編碼調(diào)控基因，因此建議在利用基因檢測技術(shù)進行抗菌脂肽產(chǎn)生菌的篩選時，應(yīng)盡可能全面的對脂肽類類物質(zhì)的編碼調(diào)控基因進行檢測，以更準(zhǔn)確的判斷菌株產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的種類，同時也可判斷菌株是否能夠產(chǎn)生新穎的抗菌物質(zhì)。

Li等［27］研 究 了B.amyloliquefaciensSQR9四個脂肽類合成物質(zhì)編碼基因（fenA、bmyD、srfAA、dhbA）與6種土傳病原真菌平板對峙培養(yǎng)時相對表達量的變化，結(jié)果表明在與腐皮鐮刀菌（F. solani）和尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）對峙培養(yǎng)時，fenA、bmyD和srfAA基因均表現(xiàn)上調(diào)表達的趨勢。Sajitha等［28-29］研 究 了 菌 株B. subtilisB1與Lasiodiplodia theobromae平板對峙培養(yǎng)時fenB和srfAA脂肽類物質(zhì)合成編碼基因表達量的變化，表明fenB基因在對峙培養(yǎng)4 d時其表達量顯著增加，srfAA基因在細菌與病原真菌共培養(yǎng)的整個過程中表現(xiàn)出一個相對穩(wěn)定的表達量。這些研究結(jié)果均表明生防細菌在與病原真菌共培養(yǎng)條件下，能夠激活一些抗菌物質(zhì)合成基因的表達，產(chǎn)生一些抗菌物質(zhì)，從而為細菌獲得有效的生存條件。本研究中菌株md8和md9在與腐皮鐮刀菌（F. solani）共培養(yǎng)條件下，其ituD和fenA基因均表現(xiàn)上調(diào)表達，同時srfAA基因的表達量在共培養(yǎng)前期也顯著增加，表明srfAA基因編碼的表面活性素物質(zhì)在菌株md8和md9抑制牡丹根腐病原菌的過程中具有協(xié)同增效作用，結(jié)合MALDI-TOFMS分析結(jié)果，再次驗證了ituD基因編碼合成的物質(zhì)Bacillomycin D為菌株發(fā)揮抑菌作用的主要物質(zhì)種類。但其抑菌活性物質(zhì)如Iturin B、Bacillomycin D和Fengycins A對牡丹根腐病原菌的抑菌作用機制需進一步研究，同時為何表面活性素物質(zhì)編碼基因srfAA在細菌與真菌共培養(yǎng)的前期表達量相對較高，以及菌株md8和md9抑菌活性物質(zhì)成分Iturin B物質(zhì)編碼基因ituB是否也能夠被高效誘導(dǎo)表達均需做進一步的驗證試驗。

4 結(jié)論

菌株md8和md9伊枯草菌素（iturin）的合成基因ituD在與牡丹根腐病原菌對峙培養(yǎng)過程中相對表達量顯著增加。MALDI-TOF-MS分析表明2個菌株中具有抑菌作用的組分主要為伊枯草菌素類物質(zhì)Iturin B和Bacillomycins D，結(jié)合實時熒光定量PCR結(jié)果，推測菌株md8和md9在拮抗根腐病原菌過程中發(fā)揮主要生防作用的物質(zhì)為伊枯草菌素（iturin）。