擬南芥RPP1A參與幼苗生長的蛋白質組學分析

李兵娟 鄭璐 沈仁芳 蘭平

（1. 中國科學院南京土壤研究所土壤與農業可持續發展國家重點實驗室，南京 210008；2. 中國科學院大學，北京 100049）

核糖體是生命細胞合成蛋白質的場所。真核細胞中的核糖體主要存在于細胞質中。細胞質核糖體由一個60S大亞基和一個40S小亞基共同構成，包含79-81種核糖體蛋白（ribosomal proteins，RPs）和4種核糖體RNA（ribosomal RNAs，rRNAs）［1-2］。植物RPs由多拷貝基因編碼，同一種RP可能存在2個或2個以上同家族基因編碼。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中81種RPs由254個基因編碼，大部分RPs有3個或4個編碼基因，同一家族的RPs的氨基酸相似度高達65%-100%［3-5］。擬南芥中RPs同一家族不同成員在不同生長發育時期、不同組織和不同亞細胞中具有表達差異［6］。各種環境刺激下，大部分RPs的轉錄水平保持穩定，但也有部分RPs在表達水平發生了顯著的變化［7］。說明RPs不僅參與蛋白質的合成，而且具有調控功能。解析植物RPs所具有的蛋白質合成以外的功能對于揭示植物生長發育以及脅迫響應的調控機制具有重要意義。

擬南芥RPs基因缺失突變體會表現出異常的生長發育表型，包括葉片形態和種子發育等［8-10］。研究表明，擬南芥rpl7b和rps6a突變體的葉片與野生型相比更小、更窄，葉片軸面和極性異常［8］。擬南芥RPL27aC突變影響地上部發育，葉片形態、花序和花分生組織功能以及種子結實異常［11］。rpl18aB突變體花粉在花柱中生長的競爭力明顯減弱，胚胎在早期顯示出不規則的細胞分裂方向，并在球形期停滯［12］。擬南芥RPL10A不僅在萌發和早期發育中發揮作用，而且還是依賴脫落酸響應的正調節劑［13-14］。這些突變體的表型及其作用機制研究表明RPs在生長發育和脅迫響應中發揮調控作用。

不同RPs基因突變產生的表型各不相同，這可能是不同核糖體基因存在時空表達差異或者一些RPs同時具有核糖體以外的功能所導致。與動物RPs不同，植物中RPs存在龐大的同家族蛋白，且高度異質性，大大增加了功能研究的難度［3］。目前，只有少數擬南芥RPs所具有的核糖體以外的功能被報道，大部分RPs的調控功能還不清楚。為深入解析RPs的調控功能，有必要對RPs基因突變體的表型及其可能的作用機制進行解析。

核糖體磷酸蛋白P1（ribosomal phosphoprotein P1，RPP1）是酸性磷酸蛋白，該家族有3個同源基因，RPP1A、RPP1B和RPP1C［3］。前期研究表明，擬南芥根系RPP1A和RPP1C的表達量在缺鐵脅迫下顯著下降［7］。然而關于RPP1家族蛋白核糖體以外的功能還不清楚。隨著高分辨率質譜技術的發展，蛋白質組學在植物各個領域廣泛應用，可以全面快速地分析不同樣品間的蛋白質水平的差異，揭示可能的生物學機制［15］。

本研究利用rpp1a突變體解析其對植株生長的影響，進一步利用蛋白質組學闡述RPP1A缺乏對幼苗蛋白質表達水平的影響，揭示其參與調控幼苗生長的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）T-DNA插入純合 突 變 體，rpp1a-1（SAIL_210_H01）和rpp1a-2（SALK_206736C），種子購自TAIR庫（https://www.arabidopsis.org/）。rpp1a-1突變體的T-DNA插入位于啟動子區域；rpp1a-2的插入位點在蛋白質編碼區。突變體經純合鑒定后用于試驗。擬南芥生態型（Columia-0）作為野生型（WT），由本實驗室保存。

首先用75%乙醇將擬南芥種子表面消毒3 min，再置于0.5%（V/V）次氯酸鈉溶液（含0.5%的吐溫20）中震蕩洗滌10 min，最后用滅菌蒸餾水洗滌5遍。種子點播到Estelle和Somerville（ES）固體培養基上［16］，密封后置于4℃低溫避光春化2 d，在光照箱中繼續培養14 d后取樣。光照箱溫度為22℃恒溫，光照強度為60 μmol/（m2·s），光照16 h，黑暗8 h。

1.2 方法

1.2.1 植株的表型觀測 在同一固體ES培養基上，劃分區域均勻點播野生型WT和rpp1a-1和rpp1a-2突變體的種子，每種材料設置5個重復，培養14 d后測定鮮重、葉片總表面積和葉柄長度。隨機選?。?5株擬南芥植株作為一個生物學重復，用萬分之一的天平稱量鮮重。拍照記錄葉片表型，用Image J軟件對葉片總表面積和葉柄長度進行數據分析。試驗至少重復3次。

1.2.2 蛋白質的提取和定量分析 選取光照培養14d的野生型WT和rpp1a-2突變體的幼苗樣品，提取總蛋白，具體方法參照Lan等［17］方法?？偟鞍追勰┍先芙庥赟DT溶液［2%（W/V）SDS、0.1 mol/L二硫蘇糖醇、0.1 mol/L Tris-HCl和1 mmol/L苯甲基磺酰氟，pH7.6］，離心（10 000 r/min，5 min）取上清液備用。使用酶標儀（Cytation5 imaging reader，BioTek）按照色氨酸熒光法測定蛋白質濃度，激發光波長為295 nm，熒光波長為350 nm。

1.2.3 蛋白質酶解和肽段脫鹽 蛋白質酶解采用基于超濾輔助樣品制備（filter-aided sample preparation，FASP）方法［18］。蛋白質溶液（50 μg蛋白質）置于超濾管（10 K）中用尿素替換后進行還原烷基化，最后用100 μL的NH4HCO3溶液（50 mmol/L）重懸。按照1:50的質量比加入胰蛋白酶溶液（Promega），加入1 μL的100 mmol/L CaCl2溶液輕輕渦旋后，37℃反應過夜。次日，12 000 r/min離心20 min，再用50 μL的NH4HCO3溶液洗脫2次，最后加入10%的三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）至終濃度為0.4%終止酶解反應。

使用多肽脫鹽柱對酶解產物進行脫鹽［19］。脫鹽柱活化洗滌后，酶解產物用緩沖液（64%乙腈和0.2%TFA）稀釋至200 μL加入到脫鹽柱中脫鹽，1 000 r/min離心30 s，濾液再重新加到脫鹽柱離心收集濾液，重復1次，合并收集的肽段濾液，濃縮干燥，-80℃保存備用。

1.2.4 nano-LC-ESI-MS/MS檢測和非標記（labelfree）定量分析 使用納升液相色譜-電噴霧-串聯 質 譜（nano liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry，nano LC-ESIMS/MS）系統對肽段進行質譜分析，具體方法參照Yan等［19］方法。肽段樣品復溶于20 μL的0.1%甲酸中，nano液相色譜系統（DIONEX UltiMate 3000RSLC，Thermo Fisher Scientific）中 采 用C18分 析柱（Acclaim PepMapTM100，100 μm×2 cm，Thermo Fisher Scientific）進行分離。A相為0.1%甲酸的水溶液，B相為0.1%甲酸的乙腈溶液，參照Yan等［19］方法設置B相梯度。肽段經液相分離后進入質譜儀（Orbitrap Fusion Lumos，Thermo Scientific）進行檢測。質譜儀采用正離子檢測模式，母離子全掃描范圍為350-1 700m/z，一級質譜的分辨率為60 000，二級質譜的光譜掃描的分辨率為15 000，每次質譜掃描中選取20個最豐富的母離子進行高能碰撞解離碎裂用于二級質譜分析。質譜分析采用3個生物學重復，每個生物學重復設置2個技術重復。

1.2.5 蛋白質鑒定和差異蛋白的篩選 采用Proteome Discoverer軟 件（Thermo Fisher Scientific，2.3）對質譜數據進行查庫和定量分析。參考蛋白質數據庫為Araport11蛋白序列數據［20］，同時檢索原始數據庫中隨機化序列構成的誘餌數據庫（decoy database）進行質量控制。參數設置如下：蛋白質水解酶為胰蛋白酶，且允許最多有兩個位點的漏切，固定修飾為半胱氨酸的氨基甲酰甲基化（carbamidomethylation），可變修飾為甲硫氨酸的氧化修飾（oxidation），母離子質量偏差設為10 ppm，子離子的質量偏差設為0.02 Da。

高可信度蛋白質（high confidence protein）的篩選標準為：蛋白質組（master proteins）的蛋白質可信度＞99%，肽段可信度＞95%，且至少包含一個標記為“High”，蛋白質錯誤發現率（FDR）＜0.01。獲得的高可信度蛋白用于后續label-free定量分析，表達倍數（FC）≥1.5或≤0.667，且統計檢驗P＜0.05認為是差異表達蛋白質（differentially expressed proteins，DEPs）。

1.2.6 生物信息學分析 DEPs的基因GO的注釋和富集分析使用在線工具agriGO［21］（http://systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/），閾 值 為FDR＜0.05。采用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代 謝 通路數據庫對DEPs的代謝通路進行注釋，富集使用Metascapes［22］，閾值為P＜0.05。蛋白質的互作網絡檢索利用數據庫String（https://www.string-db.org/）獲得，通過Cytoscape進行可視化。

2 結果

2.1 擬南芥RPP1A缺失突變體的幼苗表型分析

擬南芥野生型WT（Col-0）和rpp1a-1和rpp1a-2突變體共同種植在ES培養基固體平板上，進行表型比較（圖1）。與WT相比，rpp1a-1和rpp1a-2突變體幼苗鮮重極顯著增加了51%以上（圖1-B）。相一致地，rpp1a-1和rpp1a-2突變體的葉片總表面積也極顯著增加了48%和52%（圖1-C和圖1-D）。突變體葉柄長度的增加更為顯著，都增加約62%（圖1-E）。土培條件下，rpp1a-1和rpp1a-2突變體在生長后期（21 d）地上部生物量與WT相比也增加，但不顯著。這表明RPP1A缺失導致擬南芥幼苗生物量增加。

圖1 擬南芥WT和rpp1a-1和rpp1a-2突變體幼苗表型Fig. 1 Seedling phenotypes of Arabidopsis thaliana WT and rpp1a-1 and rpp1a-2 mutants

2.2 蛋白質鑒定和差異蛋白質的篩選

提取生長14 d的野生型和rpp1a-2突變體幼苗總蛋白，共鑒定獲得高可信度蛋白質4 180個，其中WT和rpp1a-2分別鑒定獲得4 037個和4 102個蛋白質（圖2）。絕大部分蛋白質（3 959個，94.7%）是WT和rpp1a-2所共有。

圖2 WT和rpp1a-2突變體幼苗總蛋白質的韋恩圖Fig. 2 Venn diagram of the total proteins detected in the seedlings of WT and rpp1a-2 mutant

與WT相比，rpp1a-2突變體中有280個蛋白質的表達量具有顯著差異，差異蛋白占總蛋白質數量的6.70%。如圖3所示，差異蛋白中有98個蛋白質（35%）表達量顯著上調（FC≥1.5，且P＜0.05），182個蛋白質（65%）表達量顯著下調（FC≤0.667，且P＜0.05），下調蛋白所占比例更大。rpp1a-2突變體雖然在表型上生物量更大，但是很多蛋白質的表達量反而下降。RPP1A只在WT中檢測到，而在rpp1a-2突變體中沒有檢測到該蛋白質，表明該突變體的確在蛋白質水平功能缺失。而RPP1A的同源基因RPP1B和RPP1C在rpp1a-2突變體中的蛋白質表達豐度分別增加了24%和15%，但無顯著性差異。

圖3 WT和rpp1a-2突變體幼苗差異蛋白質的火山圖Fig. 3 Volcano plot of differentially expressed proteins identified in the WT and rpp1a-2 mutant seedlings

2.3 差異蛋白的GO功能注釋和富集分析

為進一步解析RPP1A缺失的影響，對WT和rpp1a-2突變體的DEPs進行GO功能注釋和富集（圖4）。差異蛋白質涉及23個生物學過程（biological process），主要富集在細胞過程（cellular process）、代謝過程（metabolic process）、刺激反應（response to stimulus）、脅迫響應（response to stress）、細胞成分組織或生物發生（cellular component organization or biogenesis）和氧化還原過程（oxidation-reduction process）等生物學過程。差異蛋白的分子功能（molecular function）主要為結合（binding）和催化活性（catalytic activity）。此外，在蛋白質結合（protein binding）、離子結合（ion binding）、poly（A）RNA結合（poly（A）RNA binding）和電子載體活性（electron carrier activity）等分子功能上也顯著富集。差異蛋白主要位于細胞質部分（cytoplasmic part），同時在膜（membrane）、細胞器部分（organelle part）和葉綠體（chloroplast）等細胞組分上也顯著富集。

圖4 WT和rpp1a-2突變體幼苗差異蛋白的GO富集分析Fig. 4 GO enrichment analysis of differentially expressed proteins identified in the WT and rpp1a-2 mutant seedlings

2.4 差異蛋白的KEGG富集分析

進一步對差異表達蛋白進行KEGG富集分析，以解析其參與的代謝通路。結果顯示，差異蛋白顯著富集到糖體（ath03010）、光合作用（ath00195）、mRNA檢測途徑（ath03015）、RNA降解（ath03018）、苯丙素的生物合成（ath00940）的代謝通路（表1和圖5）。其中，差異蛋白在核糖體途徑富集最為顯著。核糖體途徑中有12個蛋白質的表達量發生顯著變化，其中大部分（10個，83%）核糖體蛋白在rpp1a-2突變體中的表達量顯著下調，只有2個核糖體蛋白（RPS9M和RPS25B）的表達量在突變體中顯著上調（表1）。除了RPS9M是線粒體核糖蛋白，其他差異表達的RPs均是細胞質核糖體蛋白，且一半差異蛋白（6個）位于小亞基上。光合系統途經中富集到5個差異蛋白，其中2個上調，3個下調。鐵氧還原蛋白1（ferredoxin 1，FD1）只在WT中表達，而在rpp1a-2突變體中幾乎檢測不到。mRNA監視通路中有2個蛋白質的豐度顯著上調，4個蛋白質的豐度顯著下調。苯丙素的生物合成中大部分差異蛋白在突變體中顯著下調，包括過氧化物酶（peroxidase）和2個β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。RNA降解途徑中除了磷酸果糖激酶4（phosphofructokinase 4），其他4個差異蛋白的表達量在rpp1a-2突變體中均顯著下調。

圖5 WT和rpp1a-2突變體幼苗差異蛋白的KEGG富集分析Fig. 5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed proteins identified in the WT and rpp1a-2 mutant seedlings

表1 顯著富集的KEGG通路中的差異表達蛋白Table 1 Differentially expressed proteins in the significantly enriched KEGG pathways

續表 Continued

2.5 差異蛋白的互作網絡分析

基于280個差異蛋白通過String在線軟件構建蛋白質互作網絡，隱藏沒有相互作用的蛋白質點，得到100個相互作用的差異蛋白，共存在270種互作關系（P=0.005 24）（圖6）。其中，最大的互作模塊包括67個差異蛋白。在互作網絡中，與核糖體蛋白RPL7Ae（AT4G12600）互作的蛋白質最多，達到25個。這些互作蛋白不僅包括在rpp1a-2突變體中表達量顯著下調的核糖體蛋白（RPL31e、RPS15AD、RPS7e、RPS15等），還包括一些表達量顯著上調的RNA結合相關的蛋白質RNA解旋酶家族蛋白（RNA helicase family protein，AT2G47250）和rRNA加 工因子PUMILIO PROTEIN 24（PUM24，AT3G16810）。同時，其他一些核糖體蛋白的的互作蛋白也比較多，例如，RPS16C（AT5G18380）有19個互作蛋白，RPS25B（AT2G21580）和RPS7C（AT5G16130）有17個互作蛋白，RPP1A（AT1G01100）、RPL31A（AT2G19740）、RPL34C（AT3G28900）和RPL13D（AT5G23900）有16個互作蛋白。除了核糖體蛋白，還有一些其他代謝途徑中的蛋白質也在這個互作網絡中。mRNA監視通路中MAGO（mago nashi family protein，MAGO）家族蛋白質、SR蛋白（arginine/serine-rich 45，SR45）、RNA解旋酶（RNA helicase，LBA1）和蛋白磷酸酶2A亞基A3（protein phosphatase 2A subunit A3，PP2AA3）存在14-19個互作蛋白。此外，脅迫響應的蛋白質熱休克蛋白81.4（heat shock protein 81.4，HSP81.4）和冷休克結構域蛋白1（cold shock domain protein 1，CSDP1）、冷休克結構域蛋白（glycine-rich protein，GRP2B）也存在于互作網絡。表明rpp1a-2突變體可能通過與其他核糖體蛋白、RNA結合相關的蛋白質、mRNA監視通路和脅迫響應的蛋白質的互相作用，進而調控植株的生長。

圖6 差異蛋白的蛋白質互作網絡Fig. 6 Protein-protein interaction network of differentially expressed proteins

3 討論

核糖體作為細胞內的翻譯機器，除了翻譯功能外，往往還具有核糖體以外的功能，在植物生長發育和逆境響應中發揮重要作用［7-9，23］。研究表明，很多RPs基因突變會引起一些常見甚至罕見的個體生長發育缺陷表型［8，11，24-25］。本研究發現RPP1A缺失導致幼苗生物量顯著增加，其中，葉片面積和葉柄長度增加尤為顯著。為了進一步揭示其中的作用機制，采用基于label-free的蛋白質組學分析了WT和rpp1a-2突變體在蛋白質表達水平的差異。本研究一共檢測到280個差異蛋白，分別有98個和182個蛋白質表達量顯著上調或下調。差異蛋白主要參與細胞過程、代謝過程、刺激反應和脅迫響應等過程。通過大量擬南芥雜種樣品的轉錄組分析也表明與生物量相關的基因在細胞過程、代謝過程、刺激應答、生物調節和發育過程等生物學過程富集［26］。這表明植物生物量由多種因素累積共同決定，不僅受與植物生長發育密切相關的基因控制，而且與植物細胞內環境穩態密切相關。值得注意的是，DEPs中約1/3（93個）富集到刺激反應，包括脅迫響應、非生物刺激反應、溫度刺激反應、冷反應，其中26個蛋白質上調，67個蛋白質下調。Yang等［26］研究也表明具有高生物量雜種優勢的植株在刺激應答中表現出整體的抑制。植物具有復雜的調控機制來平衡生長和抗逆性的競爭需求應對外部環境的變化，以確保生存和繁殖。rpp1a-2突變體通過抑制對外界環境的響應，進而有利于植物在正常條件下的生長。這些差異蛋白質不僅參與脅迫響應而且也在植物生長發育中發揮調控作用。HSP81.4不僅響應熱脅迫，而且在植物胚胎發育中發揮作用［27］。CSDP1不僅響應冷脅迫，也參與調控種子的早期萌發［28］。擬南芥SPIRAL1蛋白（SPR1）是植物特異性蛋白，調節定向的細胞擴張，控制細胞骨架聚合物微管的組裝和拆卸［29］。乙烯依賴性向地性缺乏和黃綠蛋白1（ethylene-dependent gravitropism-deficient and yellow-green 1，EGY1）是金屬蛋白酶，參與調控擬南芥下胚軸的內胚層質體的大小和數量［30］。

差異蛋白最顯著富集的代謝途徑是核糖體代謝，表明RPP1A缺失首先會影響其他RPs的表達。其中，RPS9M（AT3G49080）和RPS25B（AT2G21580）的表達量在突變體中顯著上調。RPS9M是一種線粒體核糖體蛋白，是中央細胞成熟和胚乳發育所必需的蛋白質［31］。RPS9M可以與線粒體中的錨重復蛋白（ankyrin-repeat protein）ANK6相互作用，進而控制雌配子體的發育。除了RPP1A外，還有9種RPs的表達量在突變體中顯著下調，豐度只有WT的33%-63%。這些RPs（RPL31A、RPS30C、RPS7C、RPS15A、RPS16C、RPP2A）參與RNA結合［32］，但是這些RPs在生長發育中的功能仍不清楚。

除了核糖體代謝過程外，突變體中光合作用和苯丙素的生物合成代謝過程等代謝途徑也顯著富集，這表明RPP1A可能通過核糖體外的途徑影響幼苗生長。光合作用發生在植物葉片葉綠體中，將太陽能轉化為化學能，同時將CO2和水轉化為碳水化合物，是推動植物生長發育最基本的關鍵過程［33］。GO富集顯示，有76個蛋白質富集到了葉綠體，其中33個蛋白質上調，43個蛋白質下調。很多定位于葉綠體的碳代謝關鍵酶的表達量在突變體中顯著上調，例如糖酵解途徑關鍵酶磷酸果糖激酶4（phosphofructokinase 4）、磷酸甘油酸變位酶（phosphoglycerate mutase）、光合作用中的CO2固定關鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase）。這 表 明rpp1a-2突變體中的碳代謝顯著增強。KEGG富集也表明rpp1a-2突變體導致與光合作用過程相關的一些關鍵蛋白質亞基的表達量發生了顯著變化。光系統II（photosystem II，PSII）反應中心復合物中有3個關鍵亞基的表達量在rpp1a-2突變體中發生顯著變化，其中PSII反應中心蛋白D1（PSBA）和D2（PSBD）的表達量顯著上調。PSII反應中心蛋白D1和D2的合成受環境信號影響，對葉綠體發育中PSII的正常生物發生和維持光系統的功能至關重要［34-35］。因此，rpp1a-2突變體中的葉綠體中光合作用中的碳代謝和光反應的增加，有助于提高光合效率，進而促進葉片的生長。

與WT相比，rpp1a-2突變體中苯丙素的生物合成中的3個植物III類血紅素過氧化物酶（PRX71、PRX23和PRX47）和2個β-葡萄糖苷酶（BGLU21和BGLU22）的表達量顯著下調，但是過氧化物酶（PRX16和PRX72）的表達量則大大地增加。苯丙素合成代謝途徑中主要終產物之一是木質素，已有的研究表明擬南芥中PRX47［36］、PRX71［37］和PRX72［38］參與催化木質素聚合。木質素是植物細胞壁的主要組成成分，可以強化細胞壁，促進水分運輸，同時在抵御生物和非生物脅迫中發揮作用［39］。同時，苯丙素合成代謝過程中還會產生大量的次級代謝產物，在植物物種特定器官的形成和發育中發揮作用［40］。這表明RPP1A缺失可能通過影響苯丙素的生物合成進而影響植物生長。本研究還發現RPP1A功能缺乏顯著影響了mRNA監視通路和RNA降解途徑，這些調控蛋白參與植物生長發育的調控。例如，MAGO（mago nashi family protein）家族蛋白質參與植物生長。研究表明，Mago表達量降低的RNA干擾的擬南芥突變株（RNAi-AtMago）的整體發育受阻，葉片明顯變小，莖短且偶有扁化的莖［41］，而Mago過表達植株葉片增大。而本研究中rpp1a-2突變體中MAGO的表達量增加，這也可能導致葉片增大。互作分析也表明mRNA監視通路和RNA降解途徑相關的蛋白質且與核糖體蛋白密切相互作用，因此，rpp1a-2突變體中可能通過與這些蛋白的相互作用進而影響植物生長。

4 結論

擬南芥核糖體蛋白RPP1A缺失導致幼苗生物量顯著增加。擬南芥rpp1a-2突變體通過調控核糖體代謝、光合作用、mRNA監視途徑、RNA降解和苯丙素的生物合成等代謝通路中進而影響植株葉片生長。