EasyDisc法與傳統平皿計數法檢測水中菌落總數的比較

孫 杰

(上海城市水資源開發利用國家工程中心有限公司，上海 200082)

水中菌落總數作為常規微生物檢測項目之一，可以及時反映水體受微生物污染的程度。目前，國內檢測標準大多以傳統平皿計數法作為水中菌落總數的主要檢測方法。但隨著細菌種類的不斷更新，傳統平皿計數法并不適用于檢測厭氧菌、非嗜中溫及對繁殖所需營養有特殊要求的細菌[1]；在試驗過程中因操作步驟復雜易引入污染；試驗結果判定困難易造成較大的人為誤差，對試驗技術人員和檢測環境要求極高，部分實驗室難以達到。因此，不能滿足實驗室應急樣品及大批量樣品的檢測需求。與傳統平皿計數法相比，EasyDisc法具有操作簡便、外來污染及人為誤差小、無菌環境要求低等優點，且大量試驗數據證實EasyDisc法與傳統平皿計數法在檢測水中菌落總數結果上無明顯差異。因此，該方法可以廣泛應用于水中菌落總數的檢測。相較于2002年美國環保署(EPA)批準使用酶底物法(SimPlate法)檢測飲用水以及地表水中的菌落總數，傳統的平皿計數法已30余年未更新。2013年廣東省中山市供水有限公司最早將SimPlate法寫入廣東省地方標準(DB44/T 1163—2013)[2]。2019年張穎[3]等采用定量盤法(HPC for quanti-tray)檢測水中菌落總數，該方法在原理上與SimPlate法類似，與傳統平皿計數法的檢測結果相比也沒有顯著差異，但其檢測時需要100 mL樣品，且要使用封口機和紫外燈等輔助設備，操作相對繁瑣。

EasyDisc法于2021年研發成功，是一種新型的水中菌落總數檢測方法，目前在國內外還處于試用階段。其基本原理是在EasyDisc平皿底部添加有顯色底物的脫水PCA培養基，微生物在該培養基上生長代謝時所產生的酶會促進相應顯色底物反應生成藍色物質，便于計數，降低了結果判定的人為誤差。與傳統平皿計數法相比，該方法無需配制培養基，檢測過程簡便，每個樣品前處理耗時不足1 min，顯著降低了外來污染和人為誤差，提高了檢測結果的準確性及穩定性，適用于應急樣品及大批量樣品的檢測需求。

本文采用傳統平皿計數法和新型檢測技術EasyDisc法兩種檢測方法對NSI定量質控樣品和上海地區實際水樣進行檢測，并比較分析兩種方法的檢測結果[4-5]。

1 試驗部分

1.1 試驗試劑及設備

EasyDisc平皿、HPC定量質控樣品(NSI 200317)、無菌PBS緩沖液、無菌取樣瓶等耗材由IDEXX公司提供。營養瓊脂培養基購自北京陸橋技術股份有限公司；試驗使用國產隔水式恒溫培養箱，溫控精度為±0.5 ℃，經計量部門校準合格。

1.2 試驗步驟

1.2.1 水樣采集

管網水水樣取自上海某地區的管網監測點，二次供水水樣為上海居民的龍頭水。參照《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2006)，選取一次性無菌采樣瓶(含硫代硫酸鈉)作為采樣容器，并在4 h內對采集水樣進行檢測[6-8]。

1.2.2 質控樣品制備

將NSI定量質控樣品從-10 ℃冰箱取出，在室溫下平衡10～15 min后，轉移至100 mL無菌PBS緩沖液中，水平振蕩搖勻，待NSI定量質控樣品完全溶解后，30 min內進行檢測。

1.2.3 質控稀釋樣品制備

將質控樣品充分混勻后，取10 mL質控樣品轉移至100 mL無菌取樣瓶中，用無菌水稀釋至刻度線，配制成稀釋10倍的質控稀釋樣品溶液。

1.2.4 平皿計數法測定水中菌落總數方法

平皿計數法測定水中菌落總數參照《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)[8]。

1.2.5 EasyDisc法測定水中菌落總數方法

量取1 mL待測樣品加入EasyDisc平皿，充分搖勻，使樣品均勻分布于整個平皿，在室溫下靜置20 min后正置放入(36±1) ℃培養箱中培養(48±3) h后統計分析菌落總數結果。

2 結果分析

2.1 質控樣品檢測結果分析

分別以平皿計數法和EasyDisc法平行檢測同一定量質控樣品15次，其檢測結果表明兩種方法的檢測結果均在質控樣品結果可接受范圍內。為進一步評價兩種方法檢測結果的準確性，計算檢測結果與真值的相對誤差，如表1、圖1所示。EasyDisc法檢測結果與真值的相對誤差更小，更接近于真值，準確度更高；計算兩種方法相對誤差的標準偏差可得SD(平皿計數法)=5.84%，SD(EasyDisc法)=3.66%。綜上，EasyDisc法檢測結果與真值相對誤差的標準偏差更小，表明其與真值的相對誤差離散程度較小，性能更加穩定。

2.2 質控稀釋樣品檢測結果分析

為驗證兩種方法在低濃度樣品檢測中的準確性和穩定性，分別以平皿計數法和EasyDisc法平行檢測同一稀釋10倍的定量質控樣品15次，其檢測結果如表2、圖2所示。結果表明：平皿計數法合格率為80%，EasyDisc法合格率為100%；EasyDisc法檢測結果與真值的相對誤差更小，更接近于真值，準確度更高；兩種方法檢測結果與真值相對誤差的標準偏差為SD(平皿計數法)=14.31%，SD(EasyDisc法)=9.28%。綜上，EasyDisc法檢測低濃度樣品的準確性更高，性能更穩定。

表1 兩種方法檢測質控樣品的結果Tab.1 Detection Results of QC Samples by Both Methods

圖1 兩種方法檢測結果真值的相對誤差的標準偏差Fig.1 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Methods

2.3 實際樣品檢測結果分析

選取上海地區30組管網水樣品及50組二次供水樣品，分別以平皿計數法和EasyDisc法檢測選取的80組實際樣品，其檢測結果如表3所示。為探究兩種方法在實際樣品檢測中的相關性，根據檢測數據繪制折線圖，如圖3所示。結果表明：兩種方法的檢測結果趨勢基本相同，具有很強的相關性。

表2 兩種方法檢測質控稀釋樣品的結果Tab.2 Detection Results of QC Dilution Samples by Both Methods

圖2 兩種方法檢測結果真值的相對誤差的標準偏差Fig.2 Standard Deviation of Relative Error between Test Samples and True Values by Both Method

為進一步探究兩種方法在檢測實際樣品時是否存在差異性，以及使檢測結果呈正態分布，將運用SPSS Statistics軟件對平皿計數法和EasyDisc法的檢測結果，作對數處理后進行t檢驗分析，結果如表4所示。平皿計數法與EasyDisc法的泊松相關系數為0.894，屬極強相關性；t檢驗P=0.325(>0.05)，說明兩種檢測方法的檢測結果無顯著差異，具有高度一致性。可認為平皿計數法、EasyDisc法均可有效檢測水中菌落總數。

表3 兩種方法檢測實際樣品的結果Tab.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

圖3 兩種方法檢測實際樣品的結果Fig.3 Detection Results of Practical Samples by Both Methods

3 討論

3.1 質控樣品檢測

平皿計數法和EasyDisc法對HPC定量質控樣品檢測結果的真值相對誤差絕對值的平均值分別為6.27%和3.02%。EasyDisc法檢測HPC定量質控結果的真值相對誤差相較于平皿計數法的真值相對誤差更小，表明EasyDisc法的檢測結果更接近真值，準確度更高。與真值相對誤差的標準偏差的計算結果表明，EasyDisc法與真值相對誤差的標準偏差更小，其檢測結果與真值的相對誤差離散程度較小，性能更加穩定。

表4 兩種方法對實際樣品檢測結果的t檢驗Tab.4 T-Test of Results of Practical Sample by Both Methods

3.2 質控稀釋樣品檢測

平皿計數法和EasyDisc法對稀釋10倍的低濃度HPC定量指控樣品檢測結果的真值相對誤差絕對值的平均值分別為11.98%和8.86%；平皿計數法和EasyDisc法的檢測合格率分別為80%和100%。EasyDisc法檢測HPC稀釋10倍的低濃度定量質控結果的真值相對誤差相較于平皿計數法的真值相對誤差更小、合格率更高，表明在低濃度的情況下EasyDisc法的檢測結果準確度仍優于平皿計數法。

3.3 實際樣品檢測

對管網水和二次供水等實際樣品，平皿計數法和EasyDisc法的檢測結果泊松相關系數為0.893，屬極強相關性，t檢驗P為0.325(>0.05)，表明兩種方法檢測數據在統計學意義上無顯著差異，均可檢測水中菌落總數。

3.4 EasyDisc法優勢

EasyDisc法于2021年研發成功，是一種新型的水中菌落總數檢測方法，對傳統平皿計數法進行了顯著革新，相較于傳統的90 mm平皿，其47 mm的平皿既能減少廢棄物處理的成本又能增加實驗室檢測量。其PCA培養基已脫水固定于平皿底部，省去傳統方法中配置培養基的過程，節省大量時間的同時減少了配置培養基帶來的污染。EasyDisc法產品的1年保質期，在優化實驗室管理流程的同時，也降低了相應耗材的浪費。在PCA培養基中添加顯色底物，與微生物生長代謝所產生的酶相互反應形成藍色菌落，配合白色底部及網格線更加便于觀察，降低人為計數誤差。同時，通過大量數據分析水中菌落總數檢測干擾菌種，添加雜菌生長抑制劑，使PCA培養基對檢測環境要求大幅降低。與傳統平皿計數法相比，EasyDisc法測定質控樣品及質控稀釋樣品時，準確度及穩定性均優于傳統的平皿計數法；測定實際樣品時，其檢測結果與平皿計數法無顯著差異，但因EasyDisc法無需制備培養基，操作更加簡便，對無菌環境及檢測人員技術無明顯要求等優勢，更適用于大批量樣品及應急突發樣品的檢測。

4 結論

(1)平皿計數法測定水中菌落總數，配制培養基操作繁瑣，要求嚴格；使用高溫滅菌設備需相應資格證；試驗結果讀數人為誤差大。因此，平皿計數法不能滿足實驗室應急樣品及大批量樣品檢測的需求。EasyDisc法無需配制培養基，每個樣品前處理耗時不足1 min，檢測過程簡便，顯著降低了外來污染和人為誤差，且在實際樣品檢測中可以發現其檢測結果與平皿計數法無明顯差異。

(2)采用EasyDisc法測定水中菌落總數，具有操作更加簡便、人為誤差少、計數便捷、對試驗技術人員及試驗環境要求低等優勢，其質控樣品與真值相對誤差的標準偏差為3.66%，低于平皿計數法的5.84%，質控稀釋樣品的合格率為100%，高于平皿計數法的80%，表明其檢測結果的準確性及穩定性均優于傳統的平皿計數法，可以滿足實驗室對水中菌落總數的檢測要求。同時，該方法在應急突發樣品現場檢測方面也有很大的應用前景。

(3)鑒于EasyDisc法測定水中菌落總數操作簡便、結果準確、實驗室檢測環境要求及采購設備成本低，更適用于中小型實驗室在大批量樣品及應急突發樣品的檢測，在未來必將成為一種發展趨勢。