人食道癌相關(guān)基因-4在天然免疫及炎癥反應(yīng)中的潛在功能

龍丹丹，彭婉玲，周 銳 綜述 黨喜同 審校

西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，醫(yī)學(xué)電生理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省醫(yī)學(xué)電生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（瀘州 646000）

人食道癌相關(guān)基因-4（ECRG4）是通過(guò)比較正常人食道上皮與鱗狀食道癌患者食道上皮之間mRNA表達(dá)的差異，從正常人食道上皮克隆得到的新基因。進(jìn)一步研究證實(shí)：ECRG4在正常食道上皮組織中持續(xù)表達(dá)，在食道癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)水平與食道癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)[1]，因此ECRG4符合經(jīng)典腫瘤抑制基因的特點(diǎn)。其后，ECRG4被證實(shí)在多種組織發(fā)揮腫瘤抑制功能。此外，ECRG4廣泛分布于白細(xì)胞、上皮組織、異化上皮組織（例如：脈絡(luò)叢、中耳粘膜、腦室的管狀細(xì)胞）、腦垂體、心肌細(xì)胞及其傳導(dǎo)組織、頸動(dòng)脈竇、肺、胃、肝臟、腎上腺、皮膚粘膜及角膜等，提示ECRG4的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了傳統(tǒng)腫瘤抑制基因的范疇[2-7]。

1 ECRG4的發(fā)現(xiàn)

1998年，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所的蘇濤等[8]利用mRNA差異化顯示PCR（DD-PCR）技術(shù)，通過(guò)比較正常人食管上皮組織與河南林縣食道癌患者的食道上皮組織，從正常上皮組織中分離克隆出了4 段差異表達(dá)的基因序列。通過(guò)比對(duì)基因庫(kù)后并未發(fā)現(xiàn)任何同源序列，因此將其分別命名為人食管癌相關(guān)基因1-4（ECRG1-4）。ECRG1-4基因均在正常胚胎腦及成人腦、肝、腎、睪丸、骨髓和骨骼肌cDNA文庫(kù)中表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）研究表明：在肝、肺、乳腺、大腸和子宮內(nèi)膜等多種癌及癌旁組織中，ECRG1和ECRG2均未見表達(dá)；ECRG3在癌及癌旁組織中均有表達(dá)；ECRG4僅在某些癌及癌旁組織中表達(dá)，并且在癌旁組織的表達(dá)均高于對(duì)應(yīng)癌組織。

2001 年，畢美霞等[9]以互聯(lián)網(wǎng)為平臺(tái)，組建了一個(gè)在線實(shí)驗(yàn)室，成功發(fā)現(xiàn)了ECRG4，將其確定為一個(gè)新的基因（GeneBank：AF 325503），并定位在2 號(hào)染色體2q12.2 上。2007 年，為尋找新的肽類激素，MIRABEAU等[10]開發(fā)了Hidden Markov 模型。通過(guò)對(duì)已知人蛋白質(zhì)組的篩選，發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)新的肽類激素，Spexin 和Augurin。其中Augurin在小鼠垂體、腎上腺、脈絡(luò)叢和心臟的房室結(jié)表達(dá)。由于Augurin的編碼序列位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂第12 區(qū)2 帶的第40 個(gè)開放閱讀框架（ORF），因此將編碼這種肽激素的基因命名為C2ORF40。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：C2ORF40與ECRG4屬于同一個(gè)基因，編碼由148個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的Ecrg4蛋白（Ecrg41-148）。Augurin 實(shí) 際 是 去 掉 信 號(hào) 肽（Ecrg41-30）的Ecrg4，即Ecrg431-148。由于肽類激素在信號(hào)傳導(dǎo)及藥物研發(fā)中的潛在作用，這一發(fā)現(xiàn)又一次點(diǎn)燃了學(xué)者們對(duì)ECRG4的研究興趣。

2 ECRG4的表達(dá)與調(diào)控

ECRG4基因位于12q12.2，全長(zhǎng)17 000 bp，包含四個(gè)外顯子[11]。ECRG4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一個(gè)447 bp 的開放閱讀框，編碼一個(gè)由148個(gè)氨基酸殘基（AA）構(gòu)成的蛋白[9]。

ECRG4基因的5' 非翻譯區(qū)富含GC 序列，包括大量的CpG島。對(duì)其啟動(dòng)子序列分析表明：ECRG4啟動(dòng)子位于-780 到+420，其中含有多個(gè)Sp1 結(jié)合位點(diǎn)及一個(gè)潛在的NF-κB結(jié)合位點(diǎn)；不含經(jīng)典的TATA及CAAT盒子。轉(zhuǎn)錄因子Sp1促進(jìn)ECRG4的轉(zhuǎn)錄，而啟動(dòng)子的甲基化程度對(duì)其表達(dá)呈現(xiàn)出劑量依賴性抑制效應(yīng)[12]。為了探討食道鱗狀細(xì)胞癌中ECRG4失活的機(jī)制，YUE 等[13]采用變性高效液相色譜法（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）結(jié)合DNA 測(cè)序分析了ECRG4基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化水平，結(jié)果顯示：在不表達(dá)或低水平表達(dá)Ecrg4 的15 個(gè)食道癌組織中，12個(gè)（12/15）組織中ECRG4啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)；在20個(gè)高表達(dá)Ecrg4的癌旁組織中，僅3個(gè)（3/20）癌旁組織的ECRG4啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)；在4 個(gè)不表達(dá)Ecrg4的細(xì)胞系中，3個(gè)（3/4）細(xì)胞系的ECRG4啟動(dòng)子處于高甲基化狀態(tài)。以上結(jié)果提示：ECRG4在腫瘤組織的表達(dá)與其啟動(dòng)子的甲基化水平呈負(fù)相關(guān)。隨后，有研究進(jìn)一步證實(shí)在腫瘤細(xì)胞中加入DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑（如5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-C））后，可以明顯的增加ECRG4的表達(dá)[14]。值得一提的是，作為腫瘤抑制基因，ECRG4基因突變尚未在腫瘤組織中檢出，提示其在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào)或功能喪失（loss of function）主要由于其啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)抑制了ECRG4基因表達(dá)。這種調(diào)節(jié)方式有別于傳統(tǒng)的腫瘤抑制基因，后者的功能喪失主要源于基因突變[15-16]。

3 ECRG4編碼分泌蛋白

MIRABEAU 等最早報(bào)道了Augurin（即Ecrg431-148）為分泌蛋白，利用全長(zhǎng)ECRG4cDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293及PC3 細(xì)胞后，可以在培養(yǎng)基中檢測(cè)到Ecrg4，進(jìn)一步證實(shí)Ecrg4為分泌蛋白[17-18]。生物信息學(xué)分析顯示Ecrg4包含一個(gè)疏水性的先導(dǎo)序列（aminoacid，AA1-30）、佛林 酶（Furin，AA67-70）及 凝 血 酶（Thrombin，AA130-134）保守序列。因此，理論上Ecrg4可以被加工成至少7種Ecrg4肽段：Signal peptide（AA1-30）、Augurin（AA31-148）、Eclin（AA31-70）、Argilin（AA71-148）、16（AA132-148）、C16-Augurin（AA31-132）和C16-Argilin（AA71-132）（見圖1）。值得一提的是，Ecrg4 并非直接分泌到胞外培養(yǎng)基中。Ecrg4 分泌后其N-端（AA1-31）以共價(jià)鍵首先粘附在細(xì)胞表面，隨后被蛋白酶進(jìn)行組織或細(xì)胞特異性的加工水解。例如，用全長(zhǎng)ECRG4cDNA轉(zhuǎn)染前列腺上皮細(xì)胞系PC3后，新生成的Ecrg4（Ecrg41-148）可以在細(xì)胞膜表面檢出，其水解產(chǎn)物（Ecrg431-132和Ecrg431-148）可在培養(yǎng)基中檢出；而轉(zhuǎn)染腎上皮細(xì)胞系HEK293后，新生成的Ecrg4可在細(xì)胞膜表面檢出，而在培養(yǎng)基中并未檢測(cè)到其水解產(chǎn)物[17，19-21]。

圖1 Ecrg4蛋白的加工成及其產(chǎn)物類型Figure 1 Ecrg4 protein processing and product types

4 Ecrg4的腫瘤抑制功能

腫瘤的惡性表型是多種因素相互作用導(dǎo)致正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化的結(jié)果。隨著腫瘤研究領(lǐng)域中分子遺傳學(xué)的研究逐漸深入，人們意識(shí)到有一類基因可以負(fù)性調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及分化進(jìn)而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，研究者將這一類基因歸納命名為腫瘤抑制基因。傳統(tǒng)的腫瘤抑制基因通常具有如下特征：①在正常組織中存在；②在癌變組織中功能失活、結(jié)構(gòu)改變或表達(dá)缺陷；③將野生型的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞內(nèi)可全部或部分逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性表型。研究證實(shí)ECRG4具備上述傳統(tǒng)腫瘤抑制基因的特點(diǎn)。

在食道癌中，LI等[22]檢測(cè)了130例食道鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）組織標(biāo)本中Ecrg4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：與正常食道組織相比，有89例（68.5%）ESCC組織低水平表達(dá)Ecrg4蛋白。對(duì)其中73例ESCC患者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，Ecrg4蛋白表達(dá)水平與患者存活時(shí)間成正比。WEN等[23]評(píng)估了ESCC患者腫瘤組織中ECRG4mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ECRG4的表達(dá)水平與患者的5年累積復(fù)發(fā)率成反比，而與其5年生存率成正比。恢復(fù)ECRG4在ESCC 細(xì)胞中的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型及體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)[24-25]。

在人乳腺癌組織中，SABATIER 等[26]利用DNA 芯片和基于陣列的比較基因組雜交（array-comparative genomic hybridization，aCGH）技術(shù)，檢測(cè)了353 例浸潤(rùn)性乳腺癌和正常乳腺樣本中ECRG4mRNA的表達(dá)和拷貝數(shù)的變化，并對(duì)一個(gè)大型基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（n=1 387）進(jìn)行了meta 分析。結(jié)果表明：與正常乳腺組織相比，ECRG4在94.3%的腫瘤組織中低表達(dá)；2q12.2 區(qū)域的DNA片段缺失不影響ECRG4mRNA表達(dá)水平，提示DNA 缺失并非乳腺癌組織中ECRG4表達(dá)水平降低的主要機(jī)制。Meta分析顯示，ECRG4mRNA表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，而與腫瘤病人的預(yù)后呈正相關(guān)。YOU 等[27]為評(píng)估乳腺癌中的Ecrg4 蛋白表達(dá)狀況，利用Western Blotting檢測(cè)了20對(duì)乳腺癌組織和癌旁組織中的Ecrg4蛋白水平，并對(duì)113例乳腺癌樣品進(jìn)行了臨床病理學(xué)分析，評(píng)估了Ecrg4蛋白的表達(dá)水平和患者總體生存率之間的關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果表明，與癌旁組織相比，乳腺癌組織中的Ecrg4 蛋白表達(dá)顯著降低；臨床病理分析顯示，在47 個(gè)（47/113）原發(fā)性乳腺癌組織中，Ecrg4蛋白表達(dá)缺失與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤晚期和不良總生存率顯著相關(guān)，說(shuō)明Ecrg4蛋白表達(dá)缺失可能與乳腺癌進(jìn)程有關(guān)，其表達(dá)水平與乳腺癌的預(yù)后呈正相關(guān)。

在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中，LEE 等[20]利用ECRG4基因敲除小鼠分別建立了異種和同種膠質(zhì)瘤模型，以觀察原位腫瘤的進(jìn)程及髓系免疫細(xì)胞的定位、募集和活化。研究結(jié)果表明，Ecrg4 以旁分泌機(jī)制促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集和活化，從而降低膠質(zhì)瘤的腫瘤負(fù)擔(dān)，提高小鼠生存率；而ECRG4的缺失導(dǎo)致髓細(xì)胞募集受損、腫瘤負(fù)擔(dān)增加及小鼠存活率下降。

在肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中，GE等[28]檢測(cè)了56 例肝癌患者組織標(biāo)本中Ecrg4 蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明：49例（49/56）HCC組織中Ecrg4的表達(dá)水平較低，甚至無(wú)法檢測(cè)。Ecrg4在正常肝細(xì)胞中表達(dá)，在HCC 組織及體外培養(yǎng)的HCC 細(xì)胞中Ecrg4 表達(dá)下調(diào)；過(guò)表達(dá)ECRG4抑制HCC 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。

其后，更多的研究表明ECRG4參與抑制多種腫瘤如頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、鼻咽癌和結(jié)腸癌等的發(fā)生與發(fā)展[29-32]，證實(shí)ECRG4是一種泛腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用，ECRG4表達(dá)水平的升高可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移并促進(jìn)其凋亡。

5 ECRG4在免疫炎癥反應(yīng)中的潛在功能

LI[22]探究了ECRG4在食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中的失活機(jī)制，并在體外研究了ECRG4對(duì)ESCC細(xì)胞的抑制作用，發(fā)現(xiàn)在ESCC中ECRG4mRNA表達(dá)水平下調(diào)，基因啟動(dòng)子呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，用去甲基化藥物處理細(xì)胞后ECRG4表達(dá)水平恢復(fù)。在ESCC 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ECRG4可以抑制NF-κB的表達(dá)和入核，進(jìn)而下調(diào)NF-κB靶基因環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）的表達(dá)。LI的研究團(tuán)隊(duì)首次提出了ECRG4可能通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB 相關(guān)信號(hào)途徑發(fā)揮其腫瘤抑制的生物學(xué)作用。進(jìn)而提示ECRG4可能參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人外周血白細(xì)胞高表達(dá)Ecrg4，并與先天免疫復(fù)合物（TLR4-CD14-MD2）共定位于細(xì)胞表面[4]，提示Ecrg4 可能參與機(jī)體免疫反應(yīng)。此外，在機(jī)體應(yīng)激環(huán)境下，白細(xì)胞表面的Ecrg4 的碳端16 個(gè)氨基酸殘基可以被水解并以短肽形式被釋放，該短肽可以通過(guò)與TLR4相互作用進(jìn)入胞內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。重度燒傷病人的白細(xì)胞表面Ecrg4 伴隨機(jī)體炎癥反應(yīng)的加重發(fā)生迅速脫落，而隨著燒傷的逐步愈合，白細(xì)胞表面Ecrg4的表達(dá)逐漸恢復(fù)到基礎(chǔ)水平[33-34]。

在大鼠的中耳炎細(xì)菌感染模型中，KURABI等[2]發(fā)現(xiàn)ECRG4在正常中耳粘膜中穩(wěn)定表達(dá)，在細(xì)菌感染后迅速下調(diào)，并伴隨細(xì)胞增殖、遷移以及分泌物增加等炎癥反應(yīng)特征；而恢復(fù)ECRG4的表達(dá)可顯著抑制細(xì)菌感染所導(dǎo)致的粘膜細(xì)胞的增殖、分泌及遷移。

大鼠皮膚銳器損傷模型的研究也支持Ecrg4 對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。ECRG4mRNA 及其蛋白產(chǎn)物分布于表皮、真皮和毛囊中，皮膚刺傷后Ecrg4表達(dá)立即下調(diào)，隨著損傷的修復(fù)，Ecrg4 表達(dá)逐漸升高至基礎(chǔ)水平[35]。進(jìn)一步研究表明：基礎(chǔ)狀態(tài)下，ECRG4通過(guò)負(fù)性調(diào)控早幼粒細(xì)胞透明質(zhì)酸受體CD44的表達(dá)，以協(xié)調(diào)皮膚損傷的炎癥反應(yīng)，包括限制中性粒細(xì)胞在損傷部位的積聚，調(diào)節(jié)TLR介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[36]；機(jī)體損傷后，細(xì)胞表面的Ecrg4 水解并釋放Ecrg4 活性肽，激活NF-κB 信號(hào)通路并促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集，從而放大局部炎癥反應(yīng)；隨著細(xì)胞表面的Ecrg4的消失，Ecrg4對(duì)CD44的負(fù)調(diào)控作用消失，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)行；隨著損傷的修復(fù)，Ecrg4的表達(dá)恢復(fù)，Ecrg4重新發(fā)揮其對(duì)CD44的負(fù)調(diào)控作用[37]。

為進(jìn)一步闡明ECRG4抑制腫瘤的分子機(jī)制，LEE等[20]研究結(jié)果顯示：位于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面的Ecrg4可被凝血酶水解而釋放其碳端16個(gè)氨基酸構(gòu)成的Ecrg4133-148短肽，該短肽可以激活休眠狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)單核髓系細(xì)胞向顱內(nèi)聚集，從而調(diào)節(jié)腫瘤炎癥反應(yīng)[38]。

MORIGUCHI 等[39]在小鼠膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞（glioma-initiating cell，GIC）模型的研究中發(fā)現(xiàn)，將來(lái)源于ECRG4基因敲除鼠神經(jīng)干細(xì)胞的GIC移植到免疫功能正常小鼠后，移植細(xì)胞形成了膠質(zhì)細(xì)胞瘤，而移植來(lái)源于野生型小鼠的GIC則不形成腫瘤，提示Ecrg4可以通過(guò)調(diào)節(jié)獲得性免疫功能，進(jìn)而發(fā)揮其抗腫瘤活性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Ecrg4 的免疫調(diào)節(jié)功能涉及I 型干擾素信號(hào)傳導(dǎo)通路及應(yīng)答性T細(xì)胞如：CD4+、CD8+和NK細(xì)胞。為了進(jìn)一步揭示Ecrg4信號(hào)通路的分子機(jī)制，該實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)：Ecrg471-132可以與凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）以及一些清道夫受體（例如Scarf1、CD36 和Stabilin-1）等特異結(jié)合而進(jìn)入細(xì)胞[40]，結(jié)合后可通過(guò)MyD88 激活NF-κB 信號(hào)通路，促進(jìn)IL-6 的表達(dá)。眾所周知的是，LOX-1在炎癥反應(yīng)（例如：動(dòng)脈粥樣硬化）的進(jìn)程中起著重要的作用，以上線索提示Ecrg4可通過(guò)信號(hào)通路途徑或者受體蛋白途徑參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。

6 小結(jié)

炎癥反應(yīng)在各種生理病理反應(yīng)中廣泛存在，例如腫瘤發(fā)生、病毒感染、皮膚損傷、心肌損傷及各種慢性進(jìn)行性疾病的發(fā)生與發(fā)展。以心血管疾病為例，動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是導(dǎo)致心血管事件的主要病理生理學(xué)原因。動(dòng)脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)驅(qū)動(dòng)的慢性進(jìn)行性炎癥反應(yīng)。由于多種危險(xiǎn)因素的影響，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，促進(jìn)單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮，進(jìn)而引發(fā)慢性炎癥和氧化應(yīng)激，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。Ecrg4 存在于白細(xì)胞表面，是具有多個(gè)蛋白水解酶識(shí)別位點(diǎn)的分泌蛋白，可以被蛋白酶水解成多種活性肽，隨后可與先天性免疫復(fù)合物共定位進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)答免疫反應(yīng)。活性肽Ecrg471-132可以作為L(zhǎng)OX-1 受體的配體，與其發(fā)生特異性結(jié)合。LOX-1 可以促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展，提示Ecrg4 可能通過(guò)LOX-1 受體在動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮潛在的調(diào)節(jié)作用。但是對(duì)于Ecrg4 參與炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制的研究并不是特別的深入，因此在之后的研究中，闡明Ecrg4 調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路具有非常重要的意義。

（利益沖突：無(wú)）